1
Изобретение относится к медицине, в частности к способам определения эринита, нитросорбида и продуктов их биотрансформации в крови человека для фармакокинетических исследований больных ишемической болезнью сердца.
Цель изобретения - разработка способа определения эринита, нитросорбида и продуктов их биотрансформации в крови.
На фиг.1 изображена высокоэффективная жидкостная хроматограмма эринита и продуктов его биотрансформации в крови больного; на фиг.2 - высокоэффективная жидкостная хромато- грамма нитросорбида и продуктов его биотрансформации в сыворотке крови больного.
Способ осуществляется следующим образом.
Биологическую жидкость (кровь больного) обрабатывают буферным раствором тетрабората натрия с рН 9,18,,
экстрагируют хлороформом с последующей обработкой хлороформного слоя 0,01 н. раствором хлористоводородной кислоты, хлороформный слой обезвоживают сульфатом натрия и упаривают досуха, после чего сухой остаток растворяют в смеси метанол - 0,01 н. раствор хлористоводородной кислоты 25:75 с последующим определением исследуемого лекарственного вещества и продуктов их биотрансформации на высокоэффективном жидкостном хроматографе .
Определение сложных эфиров азотной кислоты проводят на высокоэффективном жидкостном хроматографе Altex-320 (США), колонка Spherisorb 5 fj длина колонки 25 см, диаметр 4,6 мм, заполненной обратнофазным нитрипьным сорбентом с применением УФ-детектора при им, скорость элюирования 1 мм/мин, чувствительность 0,02. ,
О)
4-
00
00
со
В качестве подвижной фазы используют смесь метанол: фосфатный буфер 40:60.
Для количественного анализа препаратов нитрогруппы готовят растворы исследуемых препаратов в-смеси мета- нол-0,1 М фосфатный буфер 40:60, содержащие в объеме 50 мкл 5, 10, 15, 25, 100, 200 нг лекарственного вещества. Исследуемые растворы вводят микрошприцем в хроматограф. Площади пиков на хроматограмме вычисляют пу- .тем умножения высоты пика на ширину на середине высоты. На основе полученных данных строят калибровочный график, выражающий прямо пропорциональную зависимость между величиной площади пика препарата на хромато- граммах от количества введенного вещества. Минимально детектируемое количество эринита, нитросорбида и изосорбид-5-мононитрата 5 нг.
Приготовление растворов стандартных образцов эринита, нитросорбида.
0,0100 г чистой субстанции помещают в мерную колбу емкостью 100 мл, добавляют 40 мл метанола, смешивают 3 мин (эринит на кипящей водяной бане) до растворения и доводят 0,1 М фосфатным буфером до метки (раствор А) „
10,0 мл раствора А() помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем до метки смесью растворителей метанолфосфатный буфер 40:60 (раствор Б-0,001%).
Приготовление 0,1 М фосфатного буфера. 11,5 г чистой субстанции аммония фосфорнокислого однозамещен- ного помещают в мерную колбу емкостью 1 л, прибавляют 400 мл биди- стиллята, смешивают 3 мин и доводят объем раствора бидистиллятом до метки, размешивают смесь на магнитной мешалке 10 мин.
Приготовление буферного раствора с рН 9,18 из стандарт-титра (натрий тетраборнокислый Na B 07-10 рН 9,18, 25°С). В мерную колбу переносят содержимое ампулы и растворяют в дистиллированной воде. После растворения содержимого ампулы объем жидкости доводят до метки и тщательно перемешивают раствор.
Приготовление подвижной фазы (метанол-фосфатный буфер 40:60).-Б мерную колбу емкостью 200 мл помещают 80 мл метанола и доводят объем раст
вора до метки 0,1 М фосфатным буфером, смесь дегазируют в течение 5- 10 мин. Относительная ошибка определения лекарственных веществ не превышает ±3,07%.
Полнота экстракции из сыворотки крови лекарственного вещества 98,38%+ 0,62%. Ошибка определения эринита, нитросорбида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в биологических жидкостях, вносимая в результаты при хроматографическом анализе и вычислении площади, под пиком не превышает 1,62%+0,62%.
Определение и расчет концентрации лекарственного вещества проводят по формуле
20
С
а-Ь-1000 .
5
0
5
0
5
5
0
где С - концентрация лекарственного
вещества, нг/мл сыворотки; а - найденное количество вещества
в объеме 50 мкл; b - разведение; V - объем сыворотки, мкл. Методом ВЭЖХ в крови больных оп- ределены эринит и два продукта его биотрансформации с временем удерживания 5 мин, 7,2 мин (фиг.1 б.г), нитросорбид и три метаболита с временем удерживания 5,6 мин, 6,4 мин,
7.4мин (фиг.2, е.ж.и). Предлагаемый способ дает возможность определить нитросорбид и эринит в крови человека, обеспечивает одновременное определение эринита, нитросорбида и продуктов их биотрансформации. Для определения достаточен объем крови 0,1-1,0 мл, затрата времени на обработку крови и определение данным способом не превышает
1.5ч, относительная ошибка определения- +3,72%.
Способ поясняется хроматограмма- ми эринита и нитросорбида после экстракции из крови человека (фиг.1 и 2) и таблицей с метрологическими характеристиками способа.
Формула изобретения
. .Способ определения эринита, нитросорбида и продуктов их биотрансформации в крови, включающий добавление буфера рН 9,18 к сыворотке крови при их объемном соотношении 2:1,экс- т акцию хлороформом при соотношении
хлороформ:сыворотка : осаждение 6e.ii- ков смеси 0,01 N НС1, обезвоживания и упаривания смеси, растворение полученного осадка в смеси метанол 0,01 NH C1 при их соотношении 25:75, введение подготовленной пробы в жидкостной хроматограф с колонкой, Spherisorb заполненной об- ратнофазным нитрильным сорбентом, при этом в качеств подвижной сЬазы используют смесь метанол-фосфатный буфер 40:60 с последующей регистрацией оптической плотности при длине волны А 200 нм. I
Изобретение может быть использовано в медицине для исследования фармакокинетики эринита и нитросорбида в организме. Для этого используют способ высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке SPHERISORB 5 *98M с подвижной фазой метанолфосфатный буфер при соотношении 40:60, а детектирование проводят по оптической плотности при λ=200 нм. Способ позволяет определять эринит и два продукта его биотрансформации и нитросорбид и три его метаболита. 2 ил.
Эринит
5,0
50,0
200,0
Нитросор ид
- 5,0
50,0
200,0
4,9
4,8
4,8
4,95
4,85
49,3
49,7
49,65
49,0
49,7
199,0
198,0
198,5
199,5
198,0
4,9
4,8
4,9
4,9
4,85
49,3
49,0
49,3
48,0
48,5
199,0
199,0
198,0
199,5
198,9
4,86 0,0652 1,3413 0,1809 3,72
49,47 0,3114 0,6295 0,8644 1,75
198,4 0,6892 0,3473 1,9132 0,96
4,87 0,0447 0,9183 0,1241 2,55
48,82 0,5630 1,1532 1,5628 3,20
199,060,5809 0,2918 1,1625 0,81
Q Z Ч б д Ю фие.1
111
о г ч 6 8 ю
фиг. 2
