Способ определения лимфокинов Советский патент 1989 года по МПК G01N33/534 

Изобретение относится к биологии и медицине, преимущественно к иммунологии .

Цель изобретения - повышение точности определения гепатотропного лимфокина.

Пример 1 . От 15 мышей BAL В/с, самок, массой тела 18-20 г, которым вводят за 24 ч до исследования перорально 0,15 мл 7% СС14 в подсолнечном масле для индукции репарационной регенерации печени, получают властные клетки селезенки, центрифугируя взвесь клеток селезенки в растворе фикол-верографина плотностью 1,070, из расчета 5 107 клеток селезенки на 2 мл раствора, при 250 g в течение 45 мин при 4°С. Клетки отмывают дважды центрифугированием в среде 199, разбавляя надосадок, содержащий властные клетки, в соотношении 1:3, и суспендируют в среде 199 в объеме 10 мл с 100 мкКи 4 С-меченых аминокислот аланина, гистидина, триптофана, метионина, лейцина. Через 6 ч инкубации клетки осаждают центрифугированием и из надосадка высаливают меченый фактор серно-кислым аммонием при 60% насыщения - После 5- кратной отмывки центрифугированием насыщенным раствором серно-кислого аммония осадок растворяют в физиологическом растворе, забуференном трис- НС1. Выделено 1,8 10 СРМ-фактора (счет в импульсах в минуту на сцин- тшшяционном счетчике Рак-бэта).

Мембраны печени получают ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, забирая материал на границе растворов 20/42%, с последуI

Ј ЭО

05

оо со

ющим охлаждением мембран при 13000g 15 мин. Связывание мембран с СНВг -ак- тивированной сефарозой проводят по методике, рекомендуемой фирмой, из расчета 100 мкг белка мембран на 5 мл набухшей сефарозы в течение 16 ч при 4°С.

Для связывания радиоактивно-меченого гепатотропного лимфокина с фик- сированными на сефарозе мембранами печени к 0,1 мл суспензии сефарозы с иммобилизированными мембранами добавляют 0,05 мл 14С-меченого фактора активностью 15 000 СРМ. Через 30 мин инкубации при комнатной температуре проводят отмывку несвязавшегося фактора дважды по 5 мл холодного физиологического раствора, центрифугируя пробы при 600g 2 мин и декантируя надосадок. Пробы ставят в дубликатах

Просчет радиоактивности в сцин- тилляторе Брея показал связывание 3040+154 СРМ в пробе.

Пример 2. Тест-систему по примеру 1 используют для выявления немеченого гепатотропного лимфокина в исследуемой сыворотке мышей BAL В/с, у которых индуцируют репарационную регенерацию печени введением перорально четыреххлористого углерода в количестве 0,15 мл 7%-ного раствора в масле. Используют пул сывороток от пяти опытных мышей в группа на 3-й, 4-й, 5-й, 7-й и 14-й дни индукции регенерации от пяти интакт- ных животных.

Сыворотку в количестве 0,025 мл вносят в тест-систему перед внесением радиоактивно-меченого стандартног лимфокина. В присутствии сыворотки от интактных мышей связывание радиоактивно-меченого гепатотропного лимфокина составляет 2112+45 СРМ или 30,5% ингибирование связывания стандартного радиоактивно-меченого лимфокина в отсутствии сыворотки. На 3день регенерации ингибирование составляет 50,5% (1506+122 СРМ связывания), на 4-й день 5,3% (1481+3 СРМ связывания), на 5-й день 50,9% (1492+4 СРМ связывания). На 7-й и 14-й дни, когда регенерационный процесс у мышей заканчивается, ингибирование связывания не отличается от такового для интактных животных: 34,5 и 28,8% соответственно.

Пример 3. Для получения тест-системы от 15 мышей BAL В/с по

п

5 5

0 5

0

5

лучают властные клетки селезенки через 4 ч после индукции регенерацион- ного процесса по примеру 1. Клетки в тех же условиях инкубируют 1 сут и высаливают 1 С-меченый фактор серно-кислым аммонием при 80% насыщения. В качестве специфического сорбента используют мембраны печени, фиксированные на 4В сефарозе по примеру 1 .

При постановке реакции связывания 17000 СРМ-фактора в 0,1 мл физиологического раствора инкубируют с мембранами печени в присутствии или без 0,025 мл сыворотки контрольных и опытных мышей при комнатной температуре, отмывая и просчитывая результаты.

В контроле связывается 1899±129 СРМ-фактора. В присутствии сыворотки интактных мышей связывается 1452+81 СРМ меченого фактора, что составляет 11,5% ингибирования связывания в стандарте. В группе опытных мышей на 3-й день индукции регенерации печени пероральным введением 0,15 мл 7%-ного четыреххлористого углерода связывание в присутствии сыворотки этих мышей составляет 1078+107 СРМ или 38,5% ингибирования связывания стандарта. Формула изобретения

1.Способ определения лимфокинов, включающий введением их в тест-систему, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения гепатотропного лимфокина,

в качестве тест-системы используют иммобилизованные на твердом носителе мембраны клеток печени, содержащихся в растворе радиоактивно-меченого стандартного гепатотропного лимфокина, а определение в пробе осуществляют по конкурентному ингибированию связывания на носителе радиоактивно- меченого лимфокина.

2.Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стандартного радиоактивно-меченого гепа- тотропного лимфокина используют белковую фракцию из культуральной жидкости, полученную путем инкубации культуры лимфоцитов селезенки, выделенных через 4-24 ч после индукции регенерации печени, -а радиоактивно- мечеными аминокислотами и высаливанием при 60-80%-ном насыщении сернокислым аммонием.

Изобретение относится к биологии и медицине, преимущественно к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности определения гепатотропного лимфокина. Цель достигается путем внесения исследуемого раствора на иммобилизированные на твердом носителе мембраны клеток печени в присутствии раствора радиоактивно-меченого стандартного гепатотропного лимфокина с последующим выявлением лимфокина по конкурентному ингибированию связывания на носителе меченого лимфокина. Стандартный радиомеченный гепатотропный лимфокин получают путем инкубации бластных лимфоцитов селезенки, полученных через 4-24 часа после индукции регенерации печени, в культуральной среде с радиоактивно-меченными аминокислотами, с последующим высаливанием из культуральной жидкости при 60-80% насыщения сернокислым аммонием.