Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител к Са @ /MG @ - зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридом- Ной технологии и может быть использовано в экспериментальной и клинической медицине.

Цель изобретения - получение гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к Ca /Mg -зависимой эндонуклеазе лимфоцитов селезенки человека.- ,

Штамм получают следующим образом.

Штамм является продуктом слияния KnevoK селезенки мышей линии BALF/c и миеломы линии X63.Ag8.653. Мышей иммунизируют экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, содержащим фермент Са /Mg -зависимую эндонуклеазу. При этом используют две схемы иммунизации. -.

Первая схема. Мьшей линии BALB/c, самцов массой 18-20 г иммунизируют подкожно в 5 точек с использованием полного адьюванта Фрейда в дозе 100 мкг белка на мышь. Через 10 дней мышей иммунизируют повторно внутри- брюшинно в дозе 100 мкг, еще через 10 дней внутривенно вводят 200 мкг белка В течение 6 мес. мыши отдыхают, затем их иммунизируют внутривенно -в дозе 100 мкг белка на мьш1ь и через неделю проводят разрешающую иммунизацию внутриселезеночно в дозе 100 мкг белка. На 3 день клетки селезенки иммунизированных берут на гибридизацию.

Вторая схема, той же линии иммунизируют дважды экстрактом кле Ш Ч

14У721А

точных ядер лимфоцитов селезенки чеовека с интервалом 7 дней. Антиген вводят впутриселезеночно в дозе 100 мкг по белку, Гибридизахдаю лим- ,. фоцитов селезенки человека с миеломньаш слеткаг и проводят на

4суто Для слияния используют клетки i ел омы X63Ag8.6535 находящиеся в огарифмической фазе роста. Мышей д забивают цервикальной дкслокацией, асептически извлекают селезенку и готовят суспензию клеток с помощью гомогенизации в гомогенизаторе Пот- тера,

Слияние клеток осуществляют следующим образом

Суспензию миеломньгх клеток и лимфоцитов смешивают в плоскодонном стеклянном флаконе в соотношении Х) 1ИОо Флакон центрифугируют 200 g

5мин, удаляют супернатант и к осадку кл еток приливают по каплям 2 мл 50%-ного раствора полиэти тенглйколя (М,В, 1500). Клетки суспендируют лег-25 КИМ встряхиванием флакона. Через

1 мин во флакон доливают 10 мл среды DMEM, затем в течение 3 мин еще

50-60 нп. Флакон центрифугируют

200 g 5 MHHj удаляют супернатант и 30

осадок клеток ресуспендируют в 60 мл

среды DMEMj 15% фетальной сыворотки.

Клетки инкубируют во флаконе при

37°С 6-12 ч. После инкубации среду

во флаконах заменяют на селективную

среду DMEM-ГАТ; содержащую, гентамицин 80 мг/№1,,гииоксантин 5-10-3 амино- птерин , тимидин 8-10 М.

Клетки в концентрации 2-310 /мл распределяют по лункам 96-луночных :40 штаншетов, дно которых предварительно покрывают фидерным слоем синген- ньк перитонеальных макрофагов (6 з10 клеток на лунку). Клетки культивируют в планшетах при 37 С в ат- g мосфере 5% СО. и 96% влажности. Среду меняют каждые 3 сут на 50% Массовая гибель клеток отмечается на 3-6 сут культивирования на селективной среде рост гибридов наблюдается на 5-7 сут, . первое тестирование супернатантов проводят на 10 день культивирования после гибридизации. Гибридные клетки культивируют на среде UMEM с добавлением 15% фетальной сыворотки, гентами-, цикад гипоксантина, аминоптери- ка тю шдина в течение 30 дней, затем в ТО дней на

среде DMEM с 15% фетальной сыворотки.,

гента№- цином, гипоксантином, тими- дином. Дальнейшее культивирование осуществляют на среде DMEM с 15% фетальной сыворотки и гентамицином.

Клонирование гибридом проводят методом лимитирующих разведений.

В результате тестирования супернатантов от 200 культур, полученных в результате слияния миеломы с лимфоцитами мышей, иммунизированных по первой схеме, получено 8 позитивных линий гибридомных клеток I iio второй схеме иммунизации - 13 позитивных клонов из 200 первичных культур. Все стабильные позитивные линии клонированы и заморожены в жидком азоте. Клон DS клонирован еще 5 раз. Дпя наработки антител клон DS культивируют в условиях in vivo в виде асцитной жидкости в брюшной полости сингенных мышей.

Штамм депонирован под номером ВСКК (П) № 117Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Стандартные.условия культивирования. Среда для культивирования - среда Дульбеко с добавлением 10% телячьей эмбрионал-ьной сыворотки, 4 мм L-глутамина. 80 мкг/мл гентамнцина, 37 С. 5% COgj 96% влажности. Допустимо использование среды Игла,с добавлением 15% сыворотки крупного рогатого скота.

Для выраш 1вания штамма используют стеклянную или пластиковую посуду. Во флакон объемом 25 мл в 5 мл среды вносят 240 -10 клеток штамма DS. Пассаж 1 раз в 3-4 дня той же дозой клеток. Кратность рассева 1:4

Культивирование в организме живот ного. Для вырашрвания опухоли из штамма используют мьшей линии BALB/C. Свежим мьш1ам за 7-30 (оптимально 14) дней до инъекции штамма вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристава, затем инъецируют по 3, клеток на мьш1ь в 1 мл среды Игла. Асци- тическую жидкость собирают на 10- 15 день о Из асцита перевивают на свежих мьш1ей по 1-540 клеток на мьшь, 4-6 пассажей.

Характеристика получаемого продукта. Моноклональное антитело (монАТ) относится к IgG, мыши, фиксируют белок А. Способны связывать Ga /Mg -зависимую эндонуклеазу клеточных ядер спленохдатов человека

51497214

эндонуклеазы ядер лимфоцитов периферической крови человека и крупного рогатого скота, гепатоцитов крыс, се- . лезенки мышей линий СВА, С57В/С и BALB/C. МонАТ реагируют с эндонукле- азами клеточных ядер тимоцитов линий С57В/С и СВА и не реагируют с эндо- нуклеазами тимуса мышей линии BALB/c.

6

Pic пол ь-зов а.чк с штамм л n.-i.-;i icTp;:i - ется следующим примером.

Пример. Пластин 96-луночион пластинки покрывают белком А, за ем вносят тестируемые образцы культу- ральной среды штамма DS. После взаимодействия монАТ с белком А лунки промывают и вносят экстракт клеточ

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в экспериментальной и клинической медицине. Цель изобретения - получение гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к CA²⁺/MG²⁺ -зависимой эндонуклеазе лимфоцитов селезенки человека. Штамм DS получают путем слияния клеток селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, содержащим фермент CA²⁺/MG²⁺ -зависимую эндонуклеазу, и миеломы линии X63.AG8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N117Д и продуцирует антитела JGG₂ класса. Секреция антител на 4-й день культивирования 10-20 мкг/мл среды и 1-3 мг/мл асцитической жидкости. 3 табл.

При хроническом лимфолейкозе крупного io ix ядер силеноцитов человека или

рогатого скота антитела связывают эндонуклеазу лимфоцитов селезенки в меньшей степени, а фермент лимфоцитов периферической крови в большей, чем в норме Антитела не реагируют с ДНК-азой 1 поджелудочной железы быка, щелочной форфатазой человека, а также с белками крови человека.

Продуктивная способность. Секреция монАт на 4-й день культивирования 10-20 мкг в 1 мл среды и 1-3 мг в 1 мл асцитической жидкости. Синтез антител оценивают гетерогенным имму- иоферментным анализом.

Стабильность продуцирования монАТ сохраняется на протяжении 30 пассажей в культуре и 5-6 пассажей на животных, если гибридома перевивается .,

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендиру:ют в эмбриональной телячьей сыворотке, содержащей 12,5% диметилсульфоксида, в концентравди 3-410 -кл/мл, разливают в пластиковые ампулы при 4 С. Затем клетки замораживают по программе - до

-40

о

с

снижение а затем

температуры йа 1 /мин, а затем до -196° С по -10°С/мин. Размораживание: 1 мин 1ри . Клетки разводят в 10 мл полной среды и переносят в культу- ральный флакон. Жизнеспособность клеток по включению трипанового синего 75-90%.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды.

очищенный экстракт Са /Mg -зависимой эндонуклеазы. После того, как монАТ-свяжут фермент, добавляют су- перспиральную ДНК плазми.ды п)ВК 322

в качестве субстрата для фермента. Положительную реакцию опредечяют г/о гидролизу суперспиральнсй Аормь; плазмиды после электросЬоретического анализа продуктов расщепления JlJiK

Са /Mg -зависимой эндонуклеазой, фиксированной монАт.

МонАТ DS могут быть использованы как количественного определения. Са /Mg- -зависимей эндоиуклеазы,

так и для определения ее активности Ё комплексе антиген-антитело Б экстрактах тканей и биологических жидкостях.

Результаты связывания антител

штамма DS с очищенной Са /Mg i -зяБи СИМОЙ эндонуклеазой следующие;

Антитела

Активность

/Mg

зависимой эндонуклеазы, сорбированной на антитела;;.%

100 89 44.5

DS

DS 0,1 DS 3,1 Сыворотка крупного рогатого скота

45

Результаты связьшания антител штамма DS с различными луклеазами приведены в таблице.

Связывание антител штамма DS с Са /Mg -зависимой эндонуклеазой экстрактов клеточных ядер лимфохщтов селезенки человека 100%, мышей 10% и крупного рогатого скота 45%.

Использование штамма позволяет получать монАт высокой специфичности к Ca VMg -зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека,которые могут быть-использованы как для количественного и качественного определения эндонуклеазы так и для гистохимического исследова ння изоформ фермента, связанного с изучением их внутриклеточной локализации, изучения распределения изо- форм фермейта в лимфоидных органах человека, определения активности и содержания -зависимой энДо- нуклеазы при лимфопролиферативных ,заболеваниях.

b

ормула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П) № 117Д - продуцент моноклональных антител к зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.