Способ определения субпопуляций лимфоцитов Советский патент 1989 года по МПК G01N33/577 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в иммунологии.

Цель изобретения - упрощение способа и повьшение его информативности.

Пример 1. Мазки из капли крови, смешанной с гепарином, взятой из пальца больного в объемном соот- ногаении 1:10 (гепарин 5000 ед. в 1 мл) исследуются для уточнения варианта лимфобластного лейкоза.Маз- ки сушили в течение 6 ч на воздухе при комнатной температуре, завернули в алюминиевую фольгу, заморозили и хранили в холодильной установке при -18 С в течение 19ч. Затем пре- па;раты довели до комнатной температуры в течение 5 мин, сняли фольгу, 30 с фиксировали в формол-ацетоне при рН 6,6, промыли в трех сменах за- буференного физиологического раствора.

Провели двойной вариант окрашивания по схеме: первичные моноклональ- ные антитела 1 час, связующая сьгео- ротка 30 мин, ПАП комплекс (перокси- дазамоноклональные антитела к перок- сидазе) 30 мин, связующая сыворотка 15 мин, ПАП комплекс 15 мин. Каждый реагент наносили на стекло в пределах очерченного стеклографом круга в количестве мл, В качестве моноклональных антител использовали: ИКО-11, ИКО-13; ЛТ-1, с ОЛЛ, ИКО-1. Все этапы инкубации шли при комнатной температуре во влажной камере. После каждого из них стекла промывали в забуренном физиологическом растворе. Затем выявили активность перок- сидазы: 5 мг 3,3 -диаминбезодин тет- рахлорида растворили в 10 мл ЗФР и добавили 0,02 мл 3%-ного раствора перекиси водорода, мазки инкубировали в течение 3 мин. Ядра клеток до СР

N9 Ю

00

сг

красили 2%-ным раствором метиленово- го зеленого в течение 3 мин.

Реакцию лимфоцита с МКАТ определили по коричневому ободку в цитоплазме.

Получены результаиы: 6П7 ИКО-1 , 19% ИКО 6% ИКО-13%, 397, с 39% .

На основании полученных данных уточнен диагноз больного: 3-острый лимфобластный лейкоз общего типа.

П р и м е р 2. Для определения субпопуляций лимфоцитов донора приготовили мазки из лекоконцентрата, высушили на воздухе 6 ч, заморозили и хранили в холодильнике при -20 С в течение 4 дней.

Затем препараты довели до комнатной температуры в течение 20 мин,сия лч фольгу, 30 с фиксировали в формол ацетоне при рН 6,9, промыпи в трех сменах ЗФР, провели двойной вариант ПАЛ окрашивания. В качестве первичных мононуклеарных антител использовали ЛТ-1. Все планы осуществлялись при комнатной температуре во влажной камере, мазки после инкубации на каждом этапе промьтали в ЗФР. Ядра клеток докрасили 2%-ным раствором метИленового зеленого

Реакцию МКАТ к лимфоцитам определяли по коричневому ободку в цитоплазме .

Формула изобретения

Способ определения субпопулятщй лимфоцитов с помощью моноклональных антител путем приготовления цитолоtO гического препарата и проведения им- муноцитохимического окрашивания ПАП- методом, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения его информативности,

5 исследование проводят в мазках периферической крови или в мазках из лей- коконцентрата венозной крови,приготовленных посредством добавления антикоагулянта в объемном соотношении 20 антикоагулянт: кровь 1:10, высушивания, замораживания при -I 8. .-20 С, последующего доведения до комнатной температуры в течение 5-20 мин, фиксации в формол-ацетоне при рН 6,6-6,9

25 в течение 30-45 с, ингибирования активности эндогенной пероксидазы 3%-ным раствором перекиси водорода в течение 3-5 мин, проведения двойного варианта ПАП-окрашивания и оп- 30 ределения субпопуляций лимфоцитов по морфологическим признакам.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в иммунологии. Целью изобретения является упрощение и повышение информативности способа определения субпопуляций лимфоцитов с помощью моноклональных антител. Способ осуществляется путем проведения двойного варианта иммуноцитохимического ПАП - окрашивания мазков периферической крови или мазков из лейкоконцентрата венозной крови путем высушивания, замораживания, доведения до комнатной температуры, фиксации в формол-ацетоне, ингибирования активности эндогенной пероксидазы. Популяция лимфоцитов определяется при светооптической микроскопии по коричневому ободку в цитоплазме.