Способ подготовки препарата для микроскопического исследования иммунокомпетентных клеток с использованием моноклональных антител Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к технике проведения иммунологических реакций и может быть использовано при иммунодиагностике лейкозов и для определения субпопуляции лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител (МКА).

Цель изобретения - повышение эффективности и качества исследований за счет ликвидации дефицита времени при иммуно- фенотипировании клеток с МКА. возможность систематизации большого количества препаратов, возможность отбора проб у большого количества препаратов, возможность отбора проб у большого количества пациентов непосредственно в месте Лх проживания с последующим проведением исследований в лабораторных условиях, при этом снижается стоимость исследовательских работ за счет исключения из методики поли-1 -лизина.

Поставленная цель достигается тем, что в способе подготовки препаратов для микроскопических исследований иммунокомпетентных клеток с использованием моноклональных антител, включающий взятие пробы у донора, выделение чистой популяции иммунокомпетентных клеток, прикрепление клеток к предметному стеклу, ингибирование активность эндогенной пероксидазы клеток и нанесение на клетки моноклональных антител, отмывка последних и нанесение вторичных антител меченой пероксидазой, ее отмывка, проявление результатов реакции с помощью раствора 3 -3-диаминобензидина, модифицируется этап прикрепление клеток к предметному стеклу .е. в место ранее применяемого для этой цс-тм гк)пи-1.-лизина

заменяют фиксирование нанесенных на предметное стекло клеток в охлажденном до 0...+5°С 100%-ном ацетоне. По мнению автора операция фиксирование нанесенных на предметное стекло клеток в охлажденном до 0...+5°С 100%-ном растворе ацетона придают способу новые свойства; удлиняет срок сохранности препарата, что позволяет расширить масштабы применения способа во времени, в пространстве (брать пробы у большого количества людей на периферии, а обрабатывать препараты и систематизировать исследования - в центральной лаборатории).

Способ осуществляется следующим образом.

После выделения чистой популяции им- мунокомпетенттых клеток (лимфоциты, клетки костного мозга) из них готовится клеточный взвесь, так чтобы в 1 мл среды 199 содержали 8-10 млн клеток. Затем по 50 мкл клеточной взвеси вносится в каждую пара- фильную лунку предметного стекла. После этого предметное стекло с клетками инкубируется при комнатной температуре на 20 мин для осаждения клеток к стеклу. Надоса- дочную жидкость отсасывают и предметное стекло помещают в стакан, содержащий 100%-ный раствор ацетона, охлажденный до 0...+5°С. Клетки в ацетоне фиксируются в холодильнике в течение 10 мин. После этого клетки высушиваются в воздухе, и таким способом фиксированные клетки можно хранить длительное время (6-8 суток) или же сразу начать исследования. Но прежде чем начать исследование, проводят регидрата- цию с помощью инкубирования клеток в среде 199 на 10 мин при комнатной температуре. Такой препарат испытан авторами иммуноферментном методом для определения иммунологического подварианта острого лимфобластного лейкоза и для субтипирова- ния лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, Исследование проводили с использованием отечественных монокло- нальных антител серии И КО. предоставлены д.м.н. Барышниковым А.Ю. и приобретены у кооператива БИОЛАМ ВОНЦАМН СССР, г, Москва. Ниже Приводятся специфичность использованных в работе МКА.

П р и м е р 1. У здорового донора М. (порядковый № 1 в таблице 2) из локтевой вены была взята кровь для определения субпопуляции лимфоцитов. Цельную кровь разводили 1:3 средой 199, наслаивали на градиент фиколл-верографина (9 объемов крови за 3 объема градиента) и центрифугировали при 170 об/мин в течение 40 мин при комнатной температуре. Мононуклеары собирали из интерфазы пастеровской пипеткой. Клетки трижды отмывали средой 199 с помощью центрифугирования. Затем в каждую лунку 2 предметных стекол вносили по 50 мкл 1 х 106/мл исследуемых клеток. Клет- ки инкубировали 20 мин при комнатной температуре, среду отсасывали и предметные стекла помещали в охлажденном растворе ацетона при 5°С на 10 мин в холодильник. С одним из препаратов сразу начали прово

дить исследование, второй хранили в холодильнике в течение недели. Первый препарат отмывали в среде 199 за 10 мин. Ингибировали эндогенной пероксидазой клеток с помощью 3%-ного раствора На02 в

5 течение 10 мин. Затем на препарате проводили иммуноферментную реакцию по следующей схеме: на клетки наносили МКА на 30 мин, вторичная антисыворотка против иммуноглобулинов мыши, меченая-перокси0 дазой, 30 минут. Все этапы инкубации осу- ществляли во влажной камере при комнатной температуре. После каждого из них клетки промывали в среде 199, ее избыток снимали фильтровальной бумагой и, не

5 давая, клеткам высохнуть, наносили еле дующие реактивы. После всех этапов инкубации реакции проявляли с помощью раствора 3-3-диаминобензидина. Раствор диаминобензидина готовили ех

0 tempore (0,5 мг мл с добавлением 2 мкл 33%-ной перекиси водорода). Вторичную антисыворотку, меченную пероксидазой, выпускаемую НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, г. Москва, ис5 пользовали в разведении 1:20. Оценка полученных результатов показала, что у данного донора ИКР-1+ клетки составляют 22% от общего числа клеток в препарате, ИКО-87 72%, ИКО-31 21%, ИКО-86 46%, ИКО-12

0 28%, МКО 88%. Полученные данные с помощью нашего способа согласуется с данными других авторов, которые, получили с применением поли- -лизина. Аналогичные параллельные исследования с применени5 ем поли-1 лизина у данного же донора пока- зали тот же результат. Через .8 дней повторяли исследование с препаратом, хранившимся в холодильнике, и получали идентичный результат, Признаков разрушения

0 клеток и иеспецифического окрашивания не наблюдали. В препарате с поли-1 -лизином по истечении 8 дней наблюдались прорось в препарате, большинство клеток было разрушено, некоторые разрушились частично,

5 видны только обломки клеток. Наблюдается неспецифическое окрашивание клеток в виде диффузной сорбции антител веществами разрушенных клеток. Для убедительности полученных данных те же исследования были проведены у 10 здоровых доноров. Результаты этих исследований представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, принципиальных расхождений в результатах по обеим методикам не наблюдалось.

Приме р2. У больной А (табл. 3) цитологически подтвержденный диагноз - острый лимфоблаетный лейкоз. Проводили определение иммунологического подвари- анта заболевания с применением МКА. Ко- стно-мозговый пунктат поместили в среду 199, содержащую раствор гепарина (50 ед/мл). Содержащиеся в нем эритроциты лизировали с помощью гипотонического раствора. Отмывзди клетки в среде 199 три раза.,Затем а каждую лунку 2 предметных стекол вносили по 50 мкл 1 х10 /мл исследуемых кпеток. Клетки инкубировали 20 мин при комнатной температуре, Среды отсасывали, предметные стекла помещали в охлажденный раствор ацетон при 0°С. С одним из препаратов сразу начинали проводить исследование, второй хранили в холодильнике 6 суток. Проводили регидрирование клеток с помощью инкубации препарата в среде 199 за 10-мин. Ингибировали активность эндогенной пероксидазы клеток в растворе На02 в

течение 10 мин. Затем проводили иммуно- ферментную реакцию по следующей схеме: на клетки наносили МКА на 30 минут, затем вторичную знтисыворотку против иммуног- лобулиноз мышей, меченные пероксидазой

- 30 мин. Все этапы инкубации осуществляли во влажной камере при комнатной температуре. После каждой инкубации клетки промывали в среде 199, ее избыток снимали фильтровальной бумагой и, не давая клеткам высохнуть, наносили следующие реактивы. После проведения всех этапов инкубации реакции проявляли с помощью раствора 3-3-ди- аминобензидина. Раствор диаминобензидина готовили ex tempore (0,5 мг/мл с добавлением 2 мкл 33%-ного НяОа). Вторичную антисыворотку, меченную пероксидазой, выпускаемой НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, г.Москва, использовали а разведении 1:20. Оценка полученных результатов показала, что доминирующие количества бластных клеток экспрессируют Т- клеточные антигены. На основании этих данных был поставлен диагноз Т-клеточный зариант острого лимфобластного лейкоза. Аналогичные параллельные исследования с применением поли-1-лизина показали тот же результат. Через 6 дней повторно исследовали препарат, хранившийся в холодильнике, и получили идентичный результат. Признаков разрушения клеток, неспецифического окрашивания или каких-нибудь артефактов не наблюдали. В препарате с по- ли-1 -лизином по истечении 6 дней наблюдалась пророст, большинство клеток было

5 разрушено, некоторые частично разрушились, видны обломки клеток. Наблюдается также неспецифическое окрашивание препарата в виде диффузионной сорбции антител веществами разрушенных клеток. Для

10 убедительности полученных данных параллельные исследования были проведены у 12 больных с острыми лимфобластными лейкозами. Результаты данного исследования представлены в табл. 3,

15 Как видно из данных табл. 3, принципиальных расхождений в результатах, полученных с применением обеих методик, не наблюдалось.

Предлагаемый способ имеет ряд пре0 имуществ перед способом с применением поли-Ь-лизина, Главные из них - общедоступность раствора ацетона, в противоположность дорогостоящей импортной поли-1-лизина. Кроме того, описанный спо5 соб сокращает рабочее время, препараты, подготовленные этим способом можно хранить 6-8 дней в холодильнике и ставить им- мунологические реакции одновременно большим количеством случаев, спланиро0 вать работы на перспективу, набрать материал непосредственно на местах проживания больных и проводить исследования в лабораторных условиях, возможность применения исследования при

5 профилактических осмотрах, переставлять реакции на одном и том же случаях с возможностью возвращения описания результатов исследования, что невозможно при использовании способа с применением по0 ли- -лизина.

Формула изобретен и я

1. Способ подготовки препарата для 5 микроскопического исследования иммуно- компетентных клеток с использованием мо- ноклональных антител путем получения клеточной взвеси из чистой популяции им- мунокомпетентных клеток, нанесения ее на 0 предметное стекло, инкубации при комнатной температуре, прикрепления клеток к предметному стеклу, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, прикрепление клеток к предметному стеклу осу- 5 ществляют путем выдерживания стекол в течение 10 мин в 100%-ном растворе ацетона, охлажденном до температуры 0-5°С.

2. Способ по п. 1,отличающийся тем, что регидратацию клеток осуществляют путем их инкубирования в среде 199 в течение 10 мин при комнатной температуре.

Таблица 1

Использование: в медицине, в частности в технике проведения иммунологических реакций. Сущность изобретения: получают клеточную взвесь из чистой популяции имму- некомпетентных клеток, наносят ее на предметное стекло, инкубируют при комнатной температуре, прикрепляют клетки к предметному стеклу с последующим ингибированием активности эндогенной пероксидазы клеток раствором перекиси водорода и проведением иммунофермёнтной реакции. При этом прикрепление клеток к предметному стеклу осуществляют путем выдерживания стекол в течении 10 мин в 100%-ном растворе ацетона, с охлажденном до 0-(+5)°С. Способ прост в ис- полнении и не требует импортных реактивов. 1 з.п. ф-лы. 3 табл. С

Специфичность моноклональных антител

Результаты параллельного проведения-субтипирования лимфоцитов

здоровых доноров с помощью моноклональных антител предлагаемым

способом и с применением поли-Ьлизина

П р и м е ч а н и е: в числителе-%-ное содержание антиген положительных клеток при фиксировании в охлажденном ацетоне, в знаменателе-%-ное содержание антиген положительных клеток при применении поли-Ь-лизина. : .

Результаты параллельного проведения иммунофенбтилйроеания клеток костного мозга у больных с острым лимфобластным лейкозом с помощью моноклональиых антител предлагаемым способом и е применением поли-Ыпиина

Таблица2

ТаблицаЭ