Среда для получения протеолитических ферментов Советский патент 1982 года по МПК C12N1/20 C12N9/48 

Изобретение относится к получению препаратов протеолитических ферментов и может быть применено в микробиологи ческой промышленности, биохимии микро организмов, i медицине и гематологии. Известна среда для получения при вьфащивании на ней ACUvrohi JCeS SplieVXjiclesштамм 35 протеаз казеинол тического и фибринолитического действия Среда содержит глюкозу (6-7%), цитрат натрия, (NH4)i504 . KH2.PQ4- Щ InS04.TeS04 tl . Недостатком йьляется многокомпонен тность состава среды, использование в ней дорогостоящих и дефицитных соединений, причем некоторых в больших количествах, длительность вырашнвания посевного материала и недостаточно вььсокий выход целевого продукта. Известна также среда для получения протеолитических ферментов путем культивирования продуцента AtiiMOmi ces rivflOSOS и микро6рганнзма-стиму ятора AotinoTTWces vioEaceus .содержащая в качестве источника углерода глкжозу, а также минеральные соли (NH )2$0, , CaCOj , Wig-S04 .FeSQi . 2:и5О4 На этой среде осуществляют вовместное , культивирование двух актизвсомицетов AC-MtTOWscee rimosos - продуцента , протеаз и Ac-twon 5Ce9 vipEdCeus 5 -Г неактивного в отношении синтеза секретируемых протеаз организма L 2 3 . Недоста тками известной среды являются использование в среде дорогостоящих продуктов в больших количествах (глюкоза 4%), недостаточно высокий выход целевого продукта, многокомпонентность состава среды и длительность выращивания посевного материала. Цель изобретения - упрощение состава среды, снижение ее себестоимости и ув&личение выхода протеаз с повышенной специфичностью к фибрину. Поставленная цель достигается тем, что среда для получения протеолитнческих

ферментов путем культивирования продуцента Actinown ces микроорганизма - стимулятора Acti ИОкп сез viofcaceuS S Г, содержащая источник у лерода и минеральные соли, в том числе углекислый кальций и двузамещенный фосфорнокисльШ калий и воду, согласно изобретению содержит в кач1естве источника углерода глицерин в количестве 1-1,2 и минеральные соли хлористый аммоний и азотнокислый натрий, при следующем соотношении, вес.%;

Глицерин1-1,2

Хлористый аммоний О,ОО2-р,ООЗ Азотнокислый натрий0,002-0,02

Двузамещенный фосфорнокислый

калий0,011-0,02

Углекислый кальгций0,3-О,4

Водопроводная

водаОстальное

Пример. В предлагаемую среду гр/л: глицерин - 11; NH4C6 - 0,02;

К2.НР04 - 0,2;NaNOs- 0,2; CaCOj - 4 после стерилизации вносят для культивирования монокультуры AcViMoyiwcee riWOSUS 5% Двухсуточного жидкого посевного материала или для смешанного культивирования 5% по объему двухсуточного жидкого посевного материала Ac-t.rimosus и 1,25% по объему двухсуточного посевного материала Act.vio6aceu :. 5Г, выращеннызс-на среде, гр/л: соевая мука ЗбУ глюкоза - 40; КН2.Р04 - 0,5;NqCe2,5;СаСОу- 6. Культивирование продуцент протеаз или смеси продуцента с Act-iiriiomvces vioEaceos 5Г осуществляют глубинным, спосрбом в колбах на 75О мл со ipo мл средц в качалках (220 об/мин) в течение 9в ч при 28С. По истечении этого времени культуральная жидкость Ac-biviOV VCe5 H T«O5ue содержит 2268 усл.ед/мл фибринолитической ак- . тивности, 42 каз. ед/мл казеинолитической активности, а в смеси - 4480 усл. ед/мл ед/мл фиьринолитичейкой активности и 68,4 каз. ед/мл казеинолитичес кой активности. Целевой продукт получают из культуральной жидкости после отделения центрифугированием клеток методом. высаливания сернокислым аммонием 0,8 насыщения.

Полученные результаты показывают, чт на предлагаемой среде происходит образование протеаз фибринолитическогю и казеинолитич€х;кого действия для подуцента протеаз в 3 раза больще, чем в известном и для смеси актиномицетов в 2,4 раза. Специфичность к фибрину в предлагаемом способе возрастает в 2 раза, в то время как в известном она падает.

Пример2. В предлагаемую сред следующего состава, гр/л; глицерин 10; МН4Се -0,02;ЫаМО,5г 0,02; KiMPQ,0,11; 4 после стерилизации вносят для культивирования монокультуры Aciinomvcee rinio5us5% двухсуточного ;жвдкого посевного материала или для смешанного культивирования 5% по объему двухсуточного жидкого посевного материала Actinowi ces vioEaceusS Г, вьфащенных на среде, гр/л; соевая мука 30; глюкоза - 40; КНаРО - О,5; МаСС 2,5; СаСО,- 6,0. Культивирование продуцента протеаз в монокультуре и смеси продуцента с AcMviovvivces viotaceusS Г осуществляют как указывалось выше. По истечении 96ч ферментативная активность составляет 2О73 усл. ед/мл по фибринолизу и 36,5 каз. ед/мл по казеинолизу. Целевой продукт получают из культуральной жидкости после отделения центрифугированием клеток методом высаливания сернокислым аммонием 0,6 насыщения.

Предлагаемая среда более экономична по сравнению с известной, тар как не содержит дефицитных пищевых компонентов. Процесс культивирования на предлагаемой среде занимает меньше времени, чем в известной, так как выращивание посевного материала требует 2 сут вместо 3 сут в известном.

В таблице представлены преимущества предлагаемой среды ,

Из данных, приведенных в таблице вино, что на предлагаемой среде в моно- культуре актиномицета фибринолитическая активность в 3 раза, а казеинолитическая - в 2 раза выше, чем в известном. При смешанном культивировании на новой среде фибринолиз возрастает в 6 раз по сравнению с чистой культурой известного способа, а казеинолиз только - в 3,7 раза, что приводит к увеличению в 2 раз специфичности к фибрину. Специфичность к фибрину - важное.свойство подобного рода ферментов, так как обеспечивает преимущественный гидролиз фибрина без воздействия на белки крови, играющие большую роль в гемостазе.

59718774

Таким обрааом.реализация изобретениясебестоимость и увеличить выход протеаз

позволяет упростить состав среды, снизитьс повышенной специфичностью к фибрину.