Штамм @ @ 81- @ -продуцент нейтральной протеазы Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 C12N9/56 C12R1/125 

да

00 4ib

Ю Изобретение относится к микробиологической промьоопенности и каоабтся получения штаммов - продуцентов нейтральной т.ротеазы, и препараты, полученные на основе фермента нейтральной протеазы, применяются в пищевой прокклилен- i ности в медицине,, кожевенной промышленности, в животноводстве и ЯР. Известен штамм Вас.subtlEis 2D3 с активностью нейтральной протеазы/равной. 52,5 ед/мл, определенной по расщеплению а казеина, что соответствует 12-13 ед/мл по метод Лелейн-Фольгдрда. Штамм Вас. subtif 203 представляет соОой только науч ный интерес, так уровень активности нейтральной протеазы, син теэнруемой этим штаммом, в 10-15 р ниже по сравнению со штаммами, используе1 «1ми на производстве Г13. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положитель ному эффекту является штамм Baci6P subtitls 103, образующий нейтральную протеазу с активностью 6070 ед/мл по методу Лелейн-Фольгард Штамм характеризуется высокой вязкостью культуральной жидкости и чувствительностью к фагам 21. Недостатком известных штаммов является сравнительно низкий уровень aKTHB.HqcTH нейтральной протеазы в производстве, высокая вязкость культуральной жидкости, что затрудняет фильтрацию, сушку и, следовательно, ограничивает применением этих штаммов только для получения неочищенного препарата протосубтилина ГЗХ. . Недостатком штамма Bac.subtiCls 103, помимо указанных качеств,является нестабильность активности нейтральной протеазы ,связанная с внезапным её снижением. Целью изобретения является получение продуцента нейтральной протеазы с высокой и стабильной активностью фермента в условиях производства, а также низкой вязкостью культуральной жидкости. Новый штамм Bac.subtiPls в1-ОГ получен генетико-селекционными приемами из штамма Вас.subtle is ВНИИгенетика-44-продуцента oL -амилазы. Штамм споробен в условиях производства в 63 м ферментерах продуцировать нейтральную протеазу с активностью до 100-118 ед/мл (метод Лелейн-Фольгарда), превосходя по активности используемые на производстве штам1«л Вас. subtifis 103. В таблице приводятся данные сопоставительного анализа по уровню активности Нейтральной протеазы, времени ферментации и объему слива, полученные при экспериментальной проверке шТаммов - нового Вас. subtieis 81-orи Вас. subtieis 103 в условиях Омутнинского химического .

Преимущества штакша Вас. subti- Jia 81-ОГ по. сравнению со штаьмом Bac.subtiPis 103: более высокий уровень актнв1 ости нейтральной протеазы (на 46% в среднем), более короткий срок ферментации, что позволяет в условиях производства экономить электроэнергию/ больший объем слива культуральной жидкости, иными

словами, более высокий выход целевого продукта, устойчивость к инфекции.

60 Штамм Bac.subti is 81-ОГ характеризуется низкой вязкостью культуральной жидкости, что отличает его от известных штаммов - продуцентов нейтральной протеазы - и таким

65 образом расширяет возможности его использования для получения очищен ных препаратов. На основе очищенных препаратов нейтральной протеазы можно получить препараты медицинского назначения. Штамм испытан в условиях Омутнинского химическог завода и характеризуется устойчиво тью к фагам распространенньш на этом заводе, и посторонней микрофлоре. За период проведенных испытаний не наблюдают ни одного случа пгщения активности ерм&ита, что позволяет сделать вывод, что Вас. subtlpis 81-ОГ НС только превосходит по уровню активности нейтральной протеиназы известные продуценты этого фермента, но является более технологичным по своим свойствам. Штамм Bac.subtiPis 81-ОГ-продуцент нейтральной протеазы хранится в Центральном музее промьлиленных микроорганизмов ВНИИгенетик и имеет регистрационный номер ЦМПМ В-2574. Биологическая характеристика штамма Bac.subtifis 81-ОГ.и пример использования штамма в производстве ных условиях в ферментерах емкостью 63 м.. Культурно-морфологические призн ки штс1мма Bac.subtitls 81-ОГ. Морфология. Клетки штамма представляют собой грамположительные, спорообразующие пгшочки размером 2,54,5-0,7 мк. Размер спор 1,0-1,2 «0,6-0,7 мк. Культуральные и физиологические| признаки штамма Bac.subtlEls 81-ОГ Мясо-пептонный агар (МПА). Чере 48 ч роста при культура образует плотные, кожистые колонии серо го цвета. Средняя часть колонии более темного цвета, края более св лые (беловатые). Поверхность колонии мелкосклгщчатая. . Мясо-пептонный бульон (ffflB). Пр выращивании в МПВ в течение 24 ч при без встряхивания рост без помутнения среды, на поверхности образуется сухая пленка. При встря хивании на качалке среда мутиеет. стоянии образуется пленка. Агаризованиая среда Хоттингера. Через 48 ч роста при культура образует желтовато-серме, кругла плоские колонии с белыми лопастными краями. Диаметр колоний 3,54,5 мм. Поверхность колоний шерохо ватая, матовая. На синтетической среде с минеральным .азотом (среда Спипайзена) культура растет в виде мелких, круглых, серовато-белых колоний диаметром 1-2 мм. Поверхность колоний матовая. На ломтиках- картофеля культура образует морщинистую, мелкоскладчатую пленку желтоватого цвета. При хранении в холодильнике при 2-4°С пленка не ослизняется в течение месяца. Желатрну разжижает. Крахмал гидролизует. Молоко пептонизирует. Отношение к источникам углерода. Глюкозу, лактозу, фруктозу, сахарозу -усваивает. Хранение штамма осуществляют в лиофильио высушенном состоянии в стеклянных гшпулах. Пример использования штамма Bac.subtlfls 81-ОГ для получения нейтргшьной протеазы в производственных условиях. Посевной материал получают выращиванием штамма Вас.subt1(is 81-ОГ в колбах в виде пленки в жидкой питательной среде следующего состава, %: крахмал 10; гц моний лимоннокислый 2-х згш цений 3; KHyPO4 0,03; itlHfO 0,15; CaSO 0,14; FeSO4 0,002J MnSO4 0,000125,- CuSO4 0,00075; h-аминобензойная кислота 0,001; вода 86,2. рН 6,0-6,3. Температура . Полученный посевной материал в количестве 0,01% от объема среды в ферментере засевают аппарат объеьюм 63 м с 30 мЗ ферментационной среды следующего состава, %; крахмал осахаренный 13; СаСО, 0,05.; КСС 0,15; СаСРгО/О ; MgSO4 0,05; (NH J-HPO- 1,2; кукурузный 3KCTpaKt 0,8; пено-. -гаситель пропииол 0,05. рН 6,6. Ферментацию осуществляют при аэрацией в течение 44 ч. Активность нейтральной, протеазы в культурной жидкости 306 ед/мтГ (метод Лелейн-Фольгарда). Культуральную жидкость высушивают на распылительной сушил1(,е« Выход препарата ГЗХ от культуральной жидкости составляет 63,5%. г Ожидаемый годовой экономический эффект от использоваиия штамма в условиях Омутнинского химического завода составляет 128 тыс.руб.