Штамм культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент ростстимулирующих факторов гибридом Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении и культивировании гибридных клеток, продуцирующих монокло- нальные антитела , применяемые в сельском хозяйстве, медицине и микробиологической промьшшенности.

Цель изобретения - получение штам ма клеток, способного продуцировать ростстимулирующие факторы гибридом в бессывороточной среде.

Штамм получен в результате селекции трансформированных фиброппастов. подкожной соединительной ткани линии L устойчивость к цитотоксическому действию бромистого этидия концентрации 1 мкг/мл и последующего суб- культивирования в среде без селективного агента и сыворотки крови в течение 1,5 года (111 пассажей). Штамм ,назван Lebr 1/1-Sf и депонирован под номером ВСКК (П) № 107 Д.

Стандартные условия выращивания. Штамм культивируют на смеси, состоящей из равных объемов ростовой среды Игла, модифицированной Дальбекко (ДМЕМ), и среды 199 без добавления сьшортки крови. Культивирование проводят в инкубаторе при 37 С в герметических флаконах.

Культуральные свойства. Способ культивирования монослойный. При пересеве каждые 96 ч кратность рассева составляет 1:3. Через 2 сут после пересева производят смену культураль- ной среды. Для пересева культуру пе4

со

СП

СО

реводят в суспензию в конди1щониро- ванной среде с помощью резинового скребка и распределяют так, чтобы кондиционированная среда составляла 30% от объема свежей среды. При ука занных условиях культивирования посевная доза составляет 1,0 10 клеток на 1 см

максимальная плотность популяции равняется 3,0 « 10 клеток ,

время удвоения популяции

на 1 см 48 ч.

При соблюдении описанных условий культивирования, клетки штамма хорошо распластьгоаются на подлржке, имеют полигональную форму и образуют много слойные культуры.

Кариологическая характеристика штамма.

Анализ 100 метафазных пластинок хромосом, окрашенных по Гимза, показал, что число хромосом в клеткггх; штамма варьирует от 44 до 112, а мо- дальньш класс популяции (58%) составляют клетки с 56 хромосомами (40 од- но- и 16 двуплечих хромосом). Распределение клеток по числу хромосом представлено в таблице в процентах.

Маркерные признаки. К числу марткерньш признаков штамма относятся / устойчивость к цитологическому действию бромистого этидия концентрации 1-5 мкг/мл и способность размножаться в среде без сыворотки крови. Оба признака стабильно воспроизводятся в ряду клеточных поколений и имеют генетическую природу. Наиболее ственным признаком клеток Lebr 1/1-S является способность к длительному размножению в среде без сьторотки.

Название полезного вещества, продуцируемого штаммом, и его характе- ристика. Клетки Lebr 1/1-Sf синтезируют ростстимулируюш е факторы. Наличие таких факторов в среде, кондиционированной клетками штамма, установлено с помощью двух общепринятых тестов. Присутствие ростстиму- лирующнх факторов обнаружено при клонировании минимально трансформированных клеток линии NRK в среде с агаром на облученной рентгеном (доза облучения 500 рад) культуре Lebr 1/1-Sf в отсутствии факторов сыворотки крови. В этих условиях эффективность клонирования клеток линии NRK составляет 5 10 . Наличие рост стимулирующих факторов установлено также по увеличению интенсивности

0

0

5

включения Н-тимидина в стац юнарные культуры минимально трансформированных клеток линии ЗТЗ. С этой целью используют 9реду, корадиционированнук клетками штамма Lebr 1/1-Sf в течение 2 сут с момента пересева, Яераз- веденная кондиционированная среда, так же как и разбавленная в 2 или 4 раза, вызьгоает более чём 2-кратное увеличение включения Н-тимидина в стационарных культурах клеток ЗТЗ.

Среды, кондиционированные клетками Lebr 1/1-Sf, сохраняют полную ростстимулирующую активность по крайней мере в течение 3 нес хранения при - 20 С, Признак продукции фактора стабильно воспроизводится в течение более чем 100 генераций, Рост- стимулируюш 1е факторы обнаруживают в культуральной среде. Концентрация общего белка через 2-3 сут в кондиционированной среде составляет 2-, 5 мкг/мл,

Ростстимулирующую активность определяют в тестах: стимуляция включения 3Н-тимидина в стационарной культуре минимально трансформированных клеток NIH ЗТЗ; индукция клонирования минимально трансформированных клеток NRK в среде с агаром, стимуляция размножения массовых культур гибридом- ных клеток в среде с пониженным содержанием сыворотки крови и увеличение эффективности клонирования гиб- ридомных клеток.

Способ криоконсервнрования. Клетки замораживают в смеси сред ДМЕМ и 199 (1:1 по объему) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого , скота и 10% DMSO, Режим замораживания: 1°С в 1 мин до -20°С, 5°С в 1 мин до -50°С и 10 С в 1 мин до . Клетки хранят в жидком азо- 5 те. Режим отогрева: водяная баня в течение 1 мин. (изнеспособ™ ность клеток после криоконсервации 75-80%.

Другие особенностей штамма. После подкожной инъекции 2-510 клеток на

5

0

0

5

мьш1ь опухоли формируются у 20% мьшей линии СЗН.

Контаминации не обнаружено. Пример 1, Штамм Lebr 1/1-Sf используют для получения кондиционированной среды, содержащей фактхэры, которые стимулируют размножение гибридом - продуцентов моноклональных антител. Кондиционированную среду

вании клеток Lebr 1/1-Sf на среде ДМЕМ и 199 (1:1 по объему) при 37°С через 2 сут после пересева. Среду отделяют от клеток центрифугированием (5000 об/мин в течение 20 мин), хранят при - 20°С и используют для культивирования гибридом - продуцентов моноклональных антител против антигенов эритроцитов крупного рогатого скота и свиней (штаммы 8Д9 и Д55). Для этого сначала получают перито- неатальный эксудат мышей с помощью промывания брюшной полости мьпии линии BALB/c 5-ю мл ростовой среды следующего состава: среда ДМЕМ, содержащая 2 NLM глутамина, 1 мМ пиру- вата натрия, 1 i;K неосновных аминокаждьп- день в течение 8 сут культивирования подсчитывают число клеток гибридомы в лунках и устанавливают титр антител в культуральнон жидкости. Титр антител определяют с помощью реакции агглютинации эритроцитов.

Полученные результаты свидетельст10 вутот о том, что добавление к-среды в среду с пониженным содержанием сыворотки крови или ее полном отсутствии стимулирует размножение гибри- домных клеток: так величина макси15 мальвой плотности в среде с 2% сы- воротки составляет 4,5 10 клеток на 1 мл, а в среде без сыворотки с питающим слоем МФ - 3,7 10 . , что незначительней отливается от таковой

кислот и 5 X 10- М 2-меркаптоэтанола 20 на среде с 10% сыворотки крови (5,2« (Гс) , После разбавления до 24 мг Гс хЮ)... мере достижения максимальсуспен ию макрофагов (МФ) распределяют по лункам двух 24-луночных панелей по 1,0-2,0 10 МФ в 0,5 мл среды на лунку и помещают в инкубатор (, 5-7% СО, 100% влажности). Через 1 сут после посева МФ клетки гибридомы осаждают центрифугированием (10 мин при 1000 об/мин), промыной плотности гибридомные клетки пересевают в среде, содержащей 25 или 50% к-среды и по крайней мере-в те- 25 чение 3 пассажей они сохраняют способность эффектно размножаться в этих условиях. Титр антител в культу- ральной жидкости возрастает пропорционально количеству клеток гибридокаждьп- день в течение 8 сут культивирования подсчитывают число клеток гибридомы в лунках и устанавливают титр антител в культуральнон жидкости. Титр антител определяют с помощью реакции агглютинации эритроцитов.

Полученные результаты свидетельствутот о том, что добавление к-среды в среду с пониженным содержанием сыворотки крови или ее полном отсутствии стимулирует размножение гибри- домных клеток: так величина максимальвой плотности в среде с 2% сы- воротки составляет 4,5 10 клеток на 1 мл, а в среде без сыворотки с питающим слоем МФ - 3,7 10 . , что незначительней отливается от таковой

ной плотности гибридомные клетки пересевают в среде, содержащей 25 или 50% к-среды и по крайней мере-в те- чение 3 пассажей они сохраняют способность эффектно размножаться в этих условиях. Титр антител в культу- ральной жидкости возрастает пропорционально количеству клеток гибридо

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении и культивировании гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела. Цель изобретения - получение штамма, способного продуцировать ростстимулирующие факторы гибридом в бессывороточной среде. Штамм LEBR 1/1 - SF получен в результате селекции трансформированных фибробластов подкожной соединительной ткани линии L на устойчивость к цитотоксическому действию бромистого этидия и характеризуется свойствами, присущими клеткам мышиного происхождения. Штамм LEBR 1/1 - SF депонирован под номером ВСКК(П) N Д107. Клетки штамма способны к длительному размножению в среде без сыворотки, что обусловлено способностью клеток синтезировать собственные ростстимулирующие факторы.

вают Гс, делят на две части и повтор- в лукке и не зависит от содержано осаждают. Одну часть ресуспензиру-ния сыворотки крови в среде, при

ют в смеси, состоящей из равных объе-достижении максимальной плотности по-

нов Гс и к-среды, содержащей 2% эм-пуляции в среде без сыворотки титр

бриональной сыворотки крови, подсчи-ь оноклональных антител не отличаеттывают число клеток и после разбавле- .ся от такового в среде с 10% сыворотния суспензии до концентрации 5 - 10ки крови,

клеток в 1 мл распределяют по лункам Таким образом, использование

24 луночной панели, не содержащей МФк-среды штамма Lebr 1/1-Sf в качестве

(1 мл суспензии на лунку). Другуюисточника ростстимулирхтощих факторов,

часть ресуспензируют в к-среде и пос- Qпозволяет не применять дорогостоящую

ле подсчета числа клеток и разбавле-эмбриональную сыворотку крови или ния до концентрации 1,0 10 клеток на 1 мл распределяют по лункам 24-лу- ночной панели, содержащей МФ (0,5 мл суспензии на лунку), Аналогично призначительно снизить ее расход при культивировании гибридом - продуцентов моноканальных антител,

45

готавливают и распределяют по лункам 24-луночно панели суспензию гибридом- ных клеток в Гс без добавления к-среды с содержанием сыворотки 2 и 10%,

45

Формула изобретения

Штамм культивируем1з1х клеток животных Mus musculus ВСКК (II) N 107 а также на панель с МФ в Гс без сы- 50 продуцент ростстимулируюпщх фак- воротки (контрольные условия), Все торов гибридом.

эмбриональную сыворотку крови или

значительно снизить ее расход при культивировании гибридом - продуцентов моноканальных антител,

эмбриональную сыворотку крови или

45

Формула изобретения

Количество хромосом

.. „ . „ 44 52 54 55 56 57 58

22 2 4 58 12 12 6 2