I .
Изобретенеие относится к усовершенствованному электрохимическому способу регенерации никотинамидадениндинуклеотида (НАД) или яико- тинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ ), которые используются для определения метаболитов.
Цель изобретения - увеличение стабильности электрода в нейтральной и слабощелочной средах - достигается модификацией стеклоуголь- ного электрода сажей, обработанной п-аминофенолом или п-фенилендиами- ном.
Пример 1. Электрохимическая регенерация НАД(Ф) .
Рабочий электрод - стеклоугле- родный стержень (СУ-1500, СУ-1200),
эпокси,цированный в тефлоновом цилиндре, погружают в диспергированную в течение 0,5-1 ч ультразвуковом при частоте 44 кГц суспензию сажи и тефлонового лака (2%) на 3-5 с. Затем электрод сушат, промывают дистиллированной водой и 0,1М фосфатным буфером. Модифицированный электрод погружают в5млО,5мМ раствора НАДН или НАДФН в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,5), проводят электролиз при 25 С и потенциале и,19 В относительно нормального водородного электрода. Через определен ное время электролиза (табл.1) спёк- трофотометрическим способом в растворе определяют количество образовавшегося НАД с использованием ал- когольдегидрогеназы или НАДФ с использованием глюкозо-6-фосфатде- гидрогеназы. ;
Результаты электролиза по предлагаемому способу приведены в табл.1,
Т а б л и ц а 1
Q 5 0
5
0
5
Аналогичные опыты проводят при концентрациях лака 3,4,5% и концентрациях сажи 15 17,5; 20%. Во всем интервале использованных концентраций получены близкие данные с точностью, указанной в табл.1.
П р и м е р 2. Окисление НАДН в буферном растворе в присутствии аскорбиновой кислоты.
Электрохимическое окисление смеси НАДН и аскорбиновой кислоты проводят в 0,1 М фосфатном буферном растворе рН 7,5 при потенциале 0,09 В относительней нормального водородного электрода на электроде, приготовленном аналогично примеру 1. Полярогра- фом 1Р-7е определяют величину тока (мкА) в зависимости от концентрацик НАДН и аскорбиновой кислоты в бу- ферном растворе.
; Зависимость тока электрода от концентрации НАДН и аскорбиновой кислоты (0,1 М фосфатный буферный раствор рН 7,5 потенциал электрода 0,09 В отн.н.в.з.) приведена в табл.2.
Из данных табл.2 видно, что в интервале концентраций НАДН 0,1 - 0,5 мМ наблюдается прямолин ная зависимость тока от концентрации. Добавление аскорбиновой кислоты не имеет значительного влияния на величину силы тока. Кроме того, достижение запредельной величины силы тока окисления аскорбиновой кислоты происходит при более низких по сравнению с НАДН концентрациях.
Таблица2
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ получения никотинамидадениндинуклеотида | 1980 |
|
SU968038A1 |
| Способ получения ферментных электродов чувствительных к метаболитам | 1979 |
|
SU891774A1 |
| Способ определения концентрации лактата | 1984 |
|
SU1242803A1 |
| Способ электрохимического определения этилового спирта и ферментный электрод для его осуществления | 1985 |
|
SU1326978A1 |
| Способ определения активности холинэстеразы | 1990 |
|
SU1728770A1 |
| Способ получения электропроводных фермент-ковакторных систем | 1975 |
|
SU593439A1 |
| Способ приготовления водородного ферментного электрода | 1982 |
|
SU1107050A1 |
| Способ определения глюкозы | 1982 |
|
SU1032401A1 |
| Способ определения тиолов | 1990 |
|
SU1728771A1 |
| УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЭЛЕКТРОЛИЗА ВОДЫ | 2007 |
|
RU2413795C2 |
Изобретение касается замещенных сахаров, в частности регенерации никотинамидадениндинуклеотида (НАД+) или никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ+), используемых для определения метаболитов, и может быть использовано в медицине. Цель - увеличение стабильности электрода в нейтральной и слабощелочной средах. Процесс ведут электролизом восстановленной формы нуклеотида на электроде (из стеклоуглерода), модифицированном сажей, обработанной П-фенилендиамином или П-аминофенолом, причем сажу предварительно диспергируют ультразвуком в суспензии ацетона, содержащей 2-5% тефлонового лака и 12-20% сажи. Электролиз ведут при 0,09-0,19 В относительно нормального водородного электрода и PH 7-8 в 0,025-0,2M фосфатном буфере. Эти условия позволяют получить селективную систему НАД+- или НАДФ+- электрод, которая в 4-5 раз стабильнее в среде с PH 7-8, что обеспечивает возможность дальнейшего определения метаболитов - лактата и этанола, в области PH, оптимальной для применяемых ферментов. Кроме того, достигается снижение энергозатрат за счет проведения электролиза при меньшем потенциале (0,09-0,19 против 0,24 В). 3 табл.
Концентра ция НАДН, мМ
Ток электрода, мкА, в
отсутствии аскорбиновой
кислоты
Ток электрода,
присутствии:
0,2 мМ аскорбиновой
кислоты, мкА
0,4 мМ аскорбиновой
кислоты
0,6 мМ аскорбиновой
кислоты
1 мМ аскорбиновой
кислоты
0,1 0,2 0,4 0,5 0,8 1
0,5 1,05 1,85 2,5 2,8 3
0,65 0,75 0,81 0,83
51497186
II р и м е р 3. Определение стабильности получаемой системы НАДСФ)- электрбд.
Готовят электрод по ранее описанной методике. Электролиз 10 мл 1мМ раствора НАД(Ф)Н в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,5) проводят при в анаэробной среде при постоянном потенциале 0,09 В относительно нормального водородного электрода (по- лярограф 1Р-7е). В течение 5 сут периодически определяют величину то - ка электрода.
Результаты изменения величины силы тока электрода при продолжительном его использовании приведены в табл.3.
10
15
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить селективную систему НАД или НАДФ -электрод по сравнению с прототипом в 4-5 раз более стабильную в нейтральной и слабощелочной среде (рН 7,0-8,0), что позволяет ее использовать для дальнейшего определения метаболитов-лак- тата и этанола в области рН, оптимальной для применяемых ферментов. Кроме того, по сравнению с прототипом (О,24В) по данному способу электролиз протекает при меньшем потенциал (0,09-0,19 в), что позволяет уменьшить конверсию энергии.
Сутки
Относительный ток, %
20
1 2 3 4 5 6
25
Как следует из этих результатов, электрод сохраняет работоспособность не менее 5 сут.
Аналогичные результаты получены при электролизе с использованием 0,025 и 0,2 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0 и 8,0).
Формула изобретения ТаблицаЗ .
Способ электрохимической регене- никотинамидадениндинуклеотида или никотцнамидадениндинуклеотидфос- фата на модифицированном электроде, включаюйщй электролиз восстановленной формы в 0,025-0,2 М фосфатном буфере, отличающийся тем, что, с целью повьшения стабильности системы в нейтральной и слабощелочной средах, стеклоуглеродный электрод модифицируют сажей, обработанной п-фенилендиамином или п-амино- фенолом, которую перед нанесением на электрод диспергируют ультразвуком в суспензии ацетона, содержащей 2-5% тефлонового лака и 12-20% сажи, а электролиз проводят при 0,09 - .
100
95
77
69
68
52
30
35
0,19 В относительно нормального водородного электрода при рН 7,0-8,0,
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить селективную систему НАД или НАДФ -электрод по сравнению с прототипом в 4-5 раз более стабильную в нейтральной и слабощелочной среде (рН 7,0-8,0), что позволяет ее использовать для дальнейшего определения метаболитов-лак- тата и этанола в области рН, оптимальной для применяемых ферментов. Кроме того, по сравнению с прототипом (О,24В) по данному способу электролиз протекает при меньшем потенциал (0,09-0,19 в), что позволяет уменьшить конверсию энергии.
20
25
30
35
0,19 В относительно нормального водородного электрода при рН 7,0-8,0,
| Gorton L., Torstensson А., Jaegf eldtf.H., Johansson G | |||
| Electto- catalytic oxidation o f reduced nicotinamide coenzymes by graphite electrodes modified with an adsorbed phenoxazinium salt, meldola blue | |||
| J.Electroanai | |||
| Cham | |||
| Колосниковая решетка с чередующимися неподвижными и движущимися возвратно-поступательно колосниками | 1917 |
|
SU1984A1 |
