Способ определения тиолов Советский патент 1992 года по МПК G01N27/333 

(Л

С

Изобретение относится к электрохимическим способам анализа тиолов (соединений общей формулы PSH) путем электролиза исследуемой пробы. С целью упрощения и уменьшения токсичности способа электролиз ведется в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 5,5-8,0, с использованием графитовых электродов, модифицированных производными тетрациано-п-хинодиметана, тетратиофульвалена и ферроцена, при потенциале 0,2-0,1 В отн, н.к.э. Измеряется анодный ток, по увеличению которого определяется концентрация тиола. Способ может быть использован для анализа сточных вод и биологических жидкостей. 9 табл.

Изобретение относится к электрическим способам анализа, конкретно к усовершенствованию способа определения концентрации тиолов, соединений содержащих SH группу, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве или других областях народного хозяйства для аналитических целей,

Тиолы - класс органических соединений, содержащих при атоме углерода группу -SH ( сульфгидрильную или меркаптогруп- пу). К тиоловым соединениям относятся и две аминокислоты - L-цистеин и глутатион, которые встречаются во всех животных тканях и играют важную роль в биохимии клетки. Некоторые тиолы, как например 2,3-димеркаптопропанол. находят применение в медицине как антидоты при отравлениях мышьяком, ртутью и при других интоксикациях, а также при аритмиях сердца, гепатоцеребральной дистрофии. Алифатические амины (2-меркаптоэтиламин) являются признанными радиозащитными агентами. Некоторые меркаптаны используют также в качестве пестицидов, в производстве полимеров и в других областях народного хозяйства. Поэтому определение тиолов важно не только в медицине, но и в сельском хозяйстве, мониторинге окружающей среды.

Известен гальваностатический способ определения тиохолина. Определение выполняется в 0,08 М трис-HCI буферном растворе, рН 7,4 с использованием сетчатого платинового анода и катода диаметром 1 см, предварительно подготовленный по спецметодике (кипячение в растворе НМОз, выдерживание в 3%-ном HaPtCle и 0,03%-ном ацетате свинца при потенциале 25 В 5 мин. Получаются оба одинаковые электроды платинированной пластины. После первого изХ|

ГО

оэ

VJ 4

мерения анод покрывается каким-то материалом. Через них пропускается постоянный ток величиной 2 мкА (снабжение током происходит от батареии 9 В) и определяется падение потенциала на аноде при наличии в растворе тиохолина, Концентрация тиола определяется по калибровочной кривой. Природа разности потенциала неясна. Он может определяться как редокс-превраще- нием тиолового соединения, так и поляризацией анода из-за образования поверхностных соединений типа сульфидов платины.

Недостатком этого метода является то, что в нем используются драгоценные металлы (платина), требуются специальные реагенты, часть которых ядовита и агресивна (НМОз. h PtCle, ацетат свинца). С использованием этой системы возможно определение тиоловых соединений лишь в чистых буферных растворах, в которых отсутствуют другие электрогенные соединения.

Наиболее близким к предлагаемому является амперометрический способ определения тиолов в боратном буферном растворе, рН 8,2-8,6 с использованием амальгамированного серебр яного, электрода. Амальгамированный серебряный электрод представляет собой серебряную проволоку, впаянную или вставленную с помощью эпоксидной смолы в стекло. Для получения амальгамы серебра торец электрода шлифуется до зеркальной поверхности и опускается на 2 мин в металлическую ртуть. В электрохимическую ячейку с 5 мл буферного раствора неизвестной концентрации тиола вводится амальгамированный серебряный и насыщенный каломельный электроды. В течение 20 мин удаляют кислород и проводят электролиз раствора при потенциале - 0,55 В отн. н.к.э. Концентрацию находят по градуировочному графику.

В реакции тиохолина со ртутью образуются меркаптиды типа Hg2(SR)2. где R CH2-CH2-N+ (СНз)з, которые восстанавливаются на электроде при потенциале - 0,55 В (отн. н.к.э):

Hg2(SR)2+ 2H+ 2е - - 2RSH+2Hg

Предельный катодный ток пропорционален концентрации тиола.

Чувствительность ртутно-серебряного электрода 0,011 А/М.

Недостатком способа является то, что он очень токсичен, так как включает использование металлической ртути, очень летучего и ядовитого металла, использование которого требует специально подготовленных и оборудованных помещений. Кроме того, метод неселективен, так как определение проводится при потенциале - 0.55 В отн. н.к.э., при котором осуществляется превращение многих примесных соединений, находящихся в реальных растворах - кислорода, ионов тяжелых металлов (Pb, Ni), хиноновых и нитросоединений и др. Способ занимает много времени, так как пер.ед каждым определением надо удалять кислород, который находится во всех водных растворах.

Целью изобретения является упрощение и уменьшение токсичности процесса оп0 ределениятиолов.

Сущность способа объясняется следующей схемой.

Адсорбированный на графитовом электроде модификатор Мох реагирует с тиола5 ми. Восстановленная форма модификатора Мвос окисляется электрохимически при потенциалах их редокс-превращения: Mox+2RSH-- MBOc+ (RS)2+2H+, .

0Способ реализуется с использованием

графитовых электродов, изготовленных из стержней (диаметром 5,9 мм) спектрально чистого графита. К одному концу стержня длиной 3-6 мм при помощи серебряного эпок5 сидного клея приклеивается медная проволока, другой конец шлифуется наждачной бумагой (250 мкм) и на нем адсорбируется модификатор. Электроды впрессовываются в тефлоновый корпус.

0 Пример 1. Определение тиолов: L-цистеина, глутатиона, меркаптоэтилами- на и дитиотриэтола с использованием графитового электрода, модифицированного тетрациано-п-хинодиметаном (ТЦХМ).

5 Электрод модифицируется путем нанесения на поверхность 40 мкл раствора ТЦХМ в толуоле (6 мг/мл). Растворитель упаривается в воздухе в течение 2 ч. Электрод погружается в термостатированную при

0 25°С стеклянную ячейку с 20 мл 0,1 М калий- фосфатного буферного раствора, рН 7,0, и с помощью полярографа ОН 105 по 3-элек- тродной схеме (в качестве рабочего электрода используется модифицированный

5 вращающийся графитовый электрод, электродом сравнения служит насыщенный каломельный электрод, вспомогательным - Pt пластинка) определяется остаточный ток. В раствор вводится 50 мкл раствора тиола. В

0 течение 30 с устанавливается новый стационарный уровень анодного тока, по изменению которого определяется концентрация тиола.

Зависимость тока электрода от концен5 трации тиола приведена в табл.1.

Потенциал ,15 В отн. н.к.э., скорость вращения электрода 325 об/мин.

Как видно из табл.1, калибровочные кривые обладают линейной характеристи-, кой до 0,6-0,7 мМ (L-цистеин. глутатион.

меркаптоэтанол, меркаптоэтиламин) и 0,25 мМ (дитиотриэтол). При больших концентрациях калибровочные кривые загибаются. Стандартные отклонения в линейных участках калибровочных кривых составляют 0,23 мкА для L-цистеина, 0,28 мкА для глутатиона, 0,27 мкА для меркаптоэтанола, 0,24 мкА для дитиотризтола и 0,36 мкА для меркапто- этиламина. Чувствительность, т.е. тангенс угла наклона прямых, составляет 0,034; 0,014; 0,030; 0,023 и 0,042 А/М для L-цистеина, меркаптоэтанола, дитиотриэтола, глутатиона и меркаптоэтиламина соответственно (чувствительность по известному способу 0,011 А/М).

Пример 2. Электрод изготавливается как в примере 1. Проводится калибровка электрода по отношению к L-цистеину и глу- татиону при разных потенциалах электрода (табл.2). Концентрации: L-цистеина 0,25мМ, глутатиона 0,4 мМ. Другие условия как в примере ;

Как видно из табл.2, в интервале от 0,3 до-0,1 В практически можно провести измерения, но оптимальные условия проведения измерений обеспечиваются при потенциале 0,15-0,075 В отн. н.к.э., поскольку отношение тока электрода к остаточному току S/N Наибольшее при этих значениях потенциала. Ниже указанного предела (т.е. - 0,2 В) не наблюдается окисление тиолов, а при потенциале более 0,2 В значительно возрастает остаточный ток, обусловленный побочными электрохимическими превращениями на рабочем электроде.

Пример 3. Электрод изготавливается как в примере 1. Проводится калибровка электрода по отношению к L-цистеину глу- татиону и дитиотриэтолу при разных рН во всем интервале рН калий-фосфатного буферного раствора (табл.3) .Концентрации: L- цистеина ,0,15 мМ, глутатиона и дитиотриэтола 0,10 мМ. Потенциал электрода 0,15 В отн. н.к.э. Другие условия как в примере 1.

Как видно из табл.3, при рН 5,5-8,0 проходит окисление тиолов, поэтому в данном интервале способ может быть осуществлен. Однако с переходом из кислых сред к нейтральным и слабощелочным увеличивается ток. Следовательно, наибольшая чувствительность определений обеспечивается при рН 7,25-8,0.

П р и м е р 4. Электрод изготавливается как в примере 1. Определяется зависимость тока электрода от скорости вращения электрода при потенциале 0,15 В (табл.4). Другие условия как в примере 1.

Как видно из табл. 4, при повышении скорости вращения электрода стационарный ток увеличивается незначительно. Поэтому во всех исследованиях использована достаточная скорость вращения 325 об/мин.

П р и м е р 5. Определение стабильно- 5 сти электрода во времени. Электрод изготавливается как в примере 1. В течение 2 мес измеряется величина тока в присутствии 0,5 мМ L-цистеина. Условия определения как в примере 1. Результаты 0 зависимости тока от продолжительности со°- хранения электрода представлены в табл.5.

Из табл.5 видно, что модифицированный ТЦХМ электрод сохраняет работоспособность в течение не менее 2 мес. За это 5 время ток падает только на 20%.

Пример 6. Определение тиолов с использованием графитового электрода, модифицированного тетратиофульваленом

(по).--.

0 На графитовый электрод диаметром 5,9 мМ наносится 40 мкл раствора ТТФ в толуоле (34 мг/мл). Растворитель упаривается в воздухе в течение 2 ч, электрод погружается в 20 мл 0,1 М калий-фосфатного

5 раствора, рН 70,0, и определяется ток. В раствор вводится 50 мкл раствора тиола в том же буферном растворе. В течение 30 с устанавливается новый стационарный уровень тока электрода.

0 Зависимость тока электрода от концентрации тиола приведена в табл.6.

,1 В отн. н.к.э. (только в случае L-цистеина 0,15 В), ш 325 об/мин, t 25°C. Как видно из табл.6, калибровочные

5 кривые обладают линейной характеристикой до 0,5-0,6 мМ (L-цистеин, глутатион, меркаптоэтанол и меркаптоэтиламин) и до 0,25 мМ (дитиотриэтол). При больших концентрациях калибровочные кривые загиба0 ются. Стандартные отклонения в линейном участке калибровочных кривых составляют 0,36 мкА для L-цистеина, 0,05 мкА для мер- каптоэтиламина, 0,004 мкА для глутатиона, 0,003 мкА для меркаптоэтанола и 0,34 мкА

5 для дитиотриэтола, а чувствительность составляет 0,034; 0,001; 0,003; 0,020 и 0.005 А/М для L-цистеина, глутатиона, маркапто- этанола, дитиоэтола и меркаптоэтиламина соответственно.

0 П р и м е р 7. Электрод изготавливается как в примере 6. Проводится калибровка электрода по отношению к L-цистеину и глу- татйону при разных потенциалах электрода (табл.7). Концентрация L-цистеина 0,5 мМ, а

5 глутатиона 0,1 мМ. Другие условия как в примере 6,

Как видно из табл.7, и остаточный ток, и ток электрода значительно уменьшаются при изменении потенциала от +0,2 до -0,1 В

отн. н.к.э. Наилучшее отношение S/N в области 0,15-0,05 В отн, н.к.э.

Пример 8. Электрод изготавливается как в примере 6. Проводится калибровка электрода по отношению к L - цистеину, глутатиону и дитиотриэтолу при разных рН (табл.8) .Концентрация 1-цистеина 0,4 мМ, глутатиона 0,9 мМ и дитиотриэтола 0,2 мМ. Е 0,1 В отн.н.к.э.Другие условия как в примере 6.

Как видно из табл.8, чувствительность электрода значительно вырастает при переходе из кислых сред в нейтральные и щелочные.

Пример 9. Определение тиола с использованием графитового электрода, модифицированного ДМФЦ (53 мг/мл).

Растворитель упаривается в воздухе в течение 2 ч. Стационарный ток окисления тиола регистрируется как в примере 1. Зависимость тока электрода от концентрации меркаптоэтиламина в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 7,0, при потенциале 0,1 В отн. н.к.э., (л) 325 об/мин, t 25°C приведена в табл.9.

Как вид но из табл.9, калибровочная кривая обладает линейной характеристикой от 1 мМ, чувствительность в этом интервале 0,003 А/М, стандартное отклонение 0,03 мкА.

Преимуществом способа является упрощение определения концентрации тиолов, вступающих в реакцию с модификатором на графитовом электроде с образованием восстановленной формы медиатора, его последующим электрохимическим окислением и увеличением анодного тока. В отличие от известного способа исключено использование металлической ртути, что требует специально подготовленного и оборудованного помещения. Исключается также предварительное удаление кислорода перед определением, занимающее 20 мин; используемый электрод не реагирует на кислород, способ

более специфичен и экспрессивен.

Формулаизобретения Способ определения тиолов, включающий электролиз исследуемого вещества в

буферном растворе и измерение тока с последующим определением концентрации тиола, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и уменьшения токсичности, электролиз ведут в калий-фосфатном

буфере в интервале потенциалов от 0,3 до -0,1 В отн. н.к.э. с использованием графитового электрода, химически модифицированного производными тетрацианохинодиметана, тетратиофульвалена или ферроцена, и концентрацию тиола определяют по увеличению анодного тока.

Т а б ли ц а 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица б

Таблица

Таблица 8

Таблица 9