Способ определения глюкозы Советский патент 1983 года по МПК G01N27/46 

Изобретение относится к исследованию и анализу материалов путем определения электрохимических параметров, а точнее, к электрохимическим методам анализа физиологически активных соединений в присутствии ферментов,

Известен способ определения глюкозы с использованием ферментов, заключающийся в измерении параметров ячейки Ьри проведении электролиза в растворе 1 .

Недостаток способа связан с одноразовым использованием ферментов и применением сложной аппаратуры. Определение глюкозы в крови требует удаления -белков.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения глюкозы с использованием глюкооксидазной мембраны, заключающийся в измерении параметров ячейки при проведении электролиза в растворе, содержащем анализируемое вещество 2j.

Недостатки известного способа зак/ ючаются в том, что при погруже нии электрода в исследуемый раствор глюкоза, проникает в мембрану, где под действием фермента образуется перекись водорода, электрохимическое окисление которого осуществляется при 0,9 В. Способ недостаточно селективен и точен, так как при этом потенциале окисляются также другие вещества, находящиеся в реальных биологических растворах (аскорбиновая кислота, мочевая кислота, аминокислоты и т.д.) .

Цель изобретения - повышение точности измерений.

Поставленная цель достигается тем что согласно способу определения глюкозы с использованием глюкооксидазной мембраны, заключающемуся в измерении параметров ячейки при проведении электролиза в растворе, содержащем анализируемое вещество, перед измерением в глюкооксидазную мембрану вводят дополнительно пероксидазу а электролиз проводят в слабощелочном растворе, в который вводят ферроцианид в концентрации, соответствующей предельному току.

Пример 1. 30 мг глюкооксидазы, 50 мг пероксидазы и 100 мг альбумина растворяют в 1 мл 0,01М фосфатного буферного раствора рН

7,2; О,Ж КС1. Смесь обрабатывают 0,08 мл 25 -ного глутарового альдегида и 0,75 мл выливают на стеклянную подложку площадью 25 см. Высшенную мембрану толщиной 0,1 мм и диаметром 2 мм накладывают на токоподводящий электрод и покрывают диализной мембраной.

Результаты определения глюкозы при помощи мембраны, содержащей глюкооксидазу и пероксидазу, в буферных растворах (0,01 М фосфатный буфер рН 7,2; 1 мМ ферроцианида калия, 25 С) представлены в табл.-1 .

Пример 2. Каталитическую мембрану изготавливают из 30 мг глюкооксидазы и 30 мг пероксидазы как в примере 1.

Результаты определения глюкозы н платиновом электроде в буферном растворе в зависимости от концентрации ферроцианида калия ( рН 7,2; 25 С; концентрация глюкозы 1,2 мМ; 0,1 В) представлены в табл.2.

Данные табл.2 показывают, что резкая зависимость от концентрации ферроцианида калия наблюдается до 1 мМ.

П р .и м е р 3- Смесь изготавливают из 30 мг глюкооксидазы и 0 мг пероксидазы аналогично примеру 1, но поливают не на стеклянную подложку, а на диализную мембрану. Высушенную мембрану толщиной 0.05 мм накладывают прямо на токоотводящий материал и прикрепляют резиновым кольцом. Определяют количество глюк десятикратно разбавленной 0,01 мМ ффатным буфером ( рН 7,2; 0,1 М КС1) крови. Для определения остаточного тока в крови 2 мл десятикратно разбавленной крови обрабатывают 1 мг глюкооксидазы и 1 мг каталазы до полного удаления глюкозы в течение 20 мин. Определение глюкозы проводя как в других примерах.

Результаты определения глюкозы в крови (стеклоуглеродный электрод, 08, концентрация (CN) 1 мМ; 0,01 М фосфатный буфер рН 7,2; п 5) представлены в табл. табл.З видно, что величина остаточного тока не превышает II, так как основные электрохимически активные вещества - аскорбиновая, мочевая кислоты - не окисляются при нулевом потенциале. Способ определения глюкозы обладает высокои точностью, коэффициент вариации не превышает 2% при п 5. Пример . Ферментную мембра ну из 30 иг глюкооксидазы и 50 мг пероксидазы изготавливают и накладывают на платиновый электрод аналогично примеру 3. Мембрану по прототипу готовят в отсутствии перокси дазы. Предлагаемый способ определения глюкозы по сравнению с прототипом предлагаемый способ - 1мМ ферроцианида калия, ОВ,стеклоуглеродный электрод)отличается селективностью и точностью. Данные табл. показывают, что согласно предлагаемому способу аскорби -новая и мочевая кислоты не мешают определению глюкозы, тогда как согласно прототипу концентрация глюкозы, определенная в смесях, в три раза превышает в буферных растворах. В глюкооксидазной мембране, содержащей пероксидазу и ферроцианид калия, происходят следующие процессы:Глюкоза + 02+ Глюкооксидаза - Глю- конолактон + ,ч 2 Fe(CN) + ZH- -+Пероксидаза - Fe(CN) + . Восстановление образующегося ферроцианида приводит к генерации тока в ячейке.Катодный ток восстановления ферроцианида мало меняется (до 0,1В), однако резко падает при более высоки значениях потенциала. Это определяет наибольший потенци ал Со, 18) действия ячейки. Нало;; ение отрицательного потенциала, к примеру 0,1 В, приводит к катодному восстановлению кислорода, поэтому является значительным остаточный ток, величина которого меняется от концентрации глюкозы. Именно этим определяется по 014 тенциал действия ячейки 0-0,1 8 отн. насыщенного Ag/AgCl электрода. Так как потенциал Ag/AqC1 электрода меняется при изменении концентрации КС 1 от насыщенного раствора до О,Ж в интервале 0,201-0,31 В отн.и.в.э., то требование проведения электрол 1за при нулевом потенциале отн. Aq/AgCl электрода полностью и однозначно задает условия реализации способа. Очевидно, вместо Aq/AgCt электрода могут быть применены другие электроды: каломельный, водородный и т.д. Но тогда способ будет (еализован, когда электролит выполняется при 0, (нормальный, каломельный электрод), + 0,201 В (нормальный водородный электрод)и т.д. Выбор рН 7,2 обусловлен физиологическим значением этого параметра. Способ применим и при более высоких рН. однако в более щелочной области уменьшается каталитическая активность ферментов. С этим связано уменьшение тока.Так,если при рН 7,2 и 0,8 мМ глюкозы ток ячейки равен мкА/см , то при рН 7,3б он равен 8,7 мкА/см, а при рН 7р5 6,3 мкА/см. Ток ячейки, реализующий предлагаемый способ, зависит от концентрации ферроцианида калия. Из данных табл.2. видно, что при увеличении концентрации ферроцианида до 1 мМ ток увеличивается, а при концентрациях соединения выше 1 мМ практически перестает меняться. Для того, чтобы ток ячейки не зависел от концентрации медиатора, применяются такие его количества, которые соответствуют предельному определении глюкозы в проточных датчиках с целью экономии реагента применяется 1 мМ раствор, но система также хорошо-действует с использованием 2 или 3 мМ ферроцианида. Таблица 1

8.7

10,1 10,1

1С,1 ,8

9,0

0,8

-0,1 -0,2

Х )

1 мМ; Концентрация

Концентрация

0,125 0,25 0,50 1,02,0 3,0 ферроцианида калия, мМ Ток ячейки,мкА/см 2,64 6, 7,92 10,32

Продолжение табл.1

5,5 7,5

Таблица

5,0 10,0 10,68 11,04 11,10 11,10 Таблица 3