Способ определения витамина В @ в цветочной пыльце Советский патент 1989 года по МПК G01N33/82 

Изобретение относится к биохимии и биохимическим методам определения свободного витамина В в цветочной пыльце.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.

Согласно предлагаемому споСобу суспендируют исследуемое вещество путем добавления 0,1 н. соляной кислоты, добавляют 2,5 М ацетата натрия до рН 4,5-5, затем добавляют железо- синеродистый калий в щелочной среде до образования тиохрома, проводят количественное определение витамина В путем флуориметрии. При этом после стадии сусп ндирования суспензию фильтруют, а после добавления ацетата натрия осуществляют осаждение белков путем 8-10-минутной инкубации исследуемого фильтра с трихлоруксусной кислотой (ТХУ), концентрация которой в фильтрате должна составлять 0,5- 1,0%, после чего осадок отделяют

центрифугированием при 2800-4000 g в течение 8-10 мин.

На фиг. 1 показана зависимость количества свободного Ьитамина В от концентрации ТХУ в фильтрате; на фиг. 2 - зависимость количества свободного витамина В от времени инкубации образцов цветочной пьшьцы на водяной бане до 100°С;на фиг. 3 - зависимость количества витамина В, от времени инкубации с ТХУ; на фиг.4- зависимость количества витамина В, от условий центрифугирования; на фиг. 5 - зависимость оптической плот- .ности при А 540 нм от времени цент- рифугирования.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Напеску 1 г цветочной пыльцы суспендируют в 20 мл 0,1 н. НС1 и перемешивают при помощи магнитной мешалки в течение 3 мин до образования гомогенной суспензии. Суспензию фильтруют через стеклянный

сл

ел

ел

;о

QD

31504

фильтр № 40. Осадок отбрасьшают, а в фильтрат добавляют 2,5 мл 2,5 М раствора ацетата натрия до рН 5,0,

Для осаждения белков в фильтрат объемом 24 мл добавляют 0,6 мл 20%-но го раствора ТХУ, кондентрация которого в фильтрате должна составлять 0,5%, и инкубируют в течение 8-10 мин при комнатной температуре. Осадок от- деляют путем центрифугирования при факторе разделения (Fp), равном 255.102-367.347 (что при данных условиях соответствует 2800-4.000 g или 5.000-6.000 об/мин при расстоянии от оси вращения ротора до частицы 10 см в течение 8-10 мин. Измеряют объем (Vgp) супернатанта.

Для перевода тиамина в тиохром (флуоресцентную форму) используют окисляющую смесь: 0,04%-ный раствор (CN)g в 15%-йом NaOH. В 5 мл супернатанта (Vj,) добавляют 3 мл окисляющей смеси, встряхивают в течение 30 с в мерной воронке. Далее прибав- ляют 12 мл изобутилового спирта и опять встряхивают в течение 1 мин. Реакционную смесь оставляют на 10 - 15 мин в темноте для расслоения.Нижний водный слой отбрасьгеают, а из изобутилового слоя берут 10 мл туда прибавляют 0,5 мл этилового.спирта и встряхивают до образования прозрачного раствора.

Флуоресцен1ц ю раствора.измеряют при помощи флеориметра ЭФ-ЗМ, используя фильтры для определения витамина В. Содержание тиамина определяют по следующей формуле:

X (А - А,): (В - B,).v,5:(V,.H)

где А - показания флуориметра для

исследуемого окисленного раствора ;

А, - показания флуориметра для ис следуемого раствора после гашения флуоресценции тихрома с 5 н. НС1; В - показания флуориметра для

стандартного раствора, в ко тором концентрация витамина В, 1 jf /1 мл;

В - показания флуориметра для

стандартного раствора после гашения флуоресценции тио- хрома с 5 н. НС1;

V „е общая вытяжка цветочной пьшь цы после центрифугирования (20 мл);

V - вытяжка цветочной пыльцы, в которой осуществляют окисление (5 мл); н - навеска образца цветочной

пыльцы. .

Пример 2. Определение оптимальных доз ТХУ.

Исследовали зависимость количества свободного витамина В от концентрации ТХУ. Данные графика (фиг. 1) показывают, что существует оптимальная концентрация ТХУ в фильтрате (0,5-1,0%), при наличии которой в вытяжке цветочной пыльцы между концентрациями адсорбированного белками и свободного витамина В устанавливается равновесие.

Как показали исследования, полное осаждение белков из фильтрата цветочной пыльцы при помощи ТХУ зависит от продолжительности инкубации (фиг.З). Максимальное количество свободного витамина В определяют пр продолжительности инкубации 8-10 мин. Более длительная инкубация нецелесообразна, а сокращение времени инкубации приводит 4 неполному осаждению белков из фильтрата.

Пример 3. Определение оптимальных условий центрифугирования. Экспериментально установлено (фиг.4) что максимальное количество витамина В определяется в супернатанте при значении центрифугального поля равном 2,800-4,000Xg, что соответствует фактору разделения (F ) 255.102- 367.347 при радиусе ротора центрифуги 10 см. Оптимальное время центрифугирования 8-10 мин (фиг. 5), Такая продолжительность центрифугирования (как показали измерения оптической плотности супернатанта при длине волны 540 нм, которой измеряется рассеивание света частицами) обусловливает прозрачность супернатанта и полное осаждение белков, что является существенным дпя количественного определения витамина В/.

Применение предлагаемого способа определения витамина В по сравнению с прототипом позволяет сократить время определения, так как исключаются такие операции, как нагревание суспензии перед и после добавления ТХУ, кроме того, отсутствует стадия удаления примесей, повысить точность определения ввиду повьшения качества исследуемых растворов (фильтрование

I I

Изобретение относится к биохимии и биохимическим методам определения свободного витамина В₁ в цветочной пыльце. Цель - ускорение и повышение точности способа. Суспендируют пыльцу в 0,1 н.соляной кислоте, отфильтровывают, к фильтрату добавляют ацетат натрия и трихлоруксусную кислоту, после 10 мин инкубации отделяют супернатат, добавляют к нему железосинеродистый калий и измеряют флуоресценцию. фиг.5.

J

Фаг.1

Конц,В

0,8 0.7 0.6 0,5

5 Конц.

15

30 Фиг.г

S t,fiuft

Конц.В)

I

г

0,7 0,4 0

Т},Я (StO ям)

12 i,MuH