Способ культивирования клеток человека и животных Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобэетение относится к клеточной биологии , а именно к выращиванию клеток в культуре, и может быть использовано в вирусологии и биотехнологии для получения клеток в больших количествах.

Цель изобретения - уменьшение себестоимости за счет использования отходов молочной промышленности.

Для приготовления среды используют отход молочной промьгащенности - . концентрат сывороточных белков, полученный методом ультрафильтрации (КСБ/УФ) и содержащий, мас.%: сухих еществ не менее 96,0, в том числе

азотистых веществ не менее 55,0, в том числе лактозы не более 0,3. Кислотность восстановленного до массовой доли сухих веществ 9,6 % ОТ концентрата, не более 28, индекс растворимости не более 0,3 мл сырого осадка.

.Массовая доля солей тяжелых металлов: меди в пересчете на медь не более 0,0008, олова в пересчете на олово не более 0,005 %, белки не менее 55,0 %, соотношение альбумина, глобулина и казеина меняется, рН 6,3.

Готовят 1%-ный раствор КСБ/УФ на дистиллированной воде, фильтруют

СП

о vl ч

со

(фильтры Millipore типНА 0,45f/ п или Nucleopore Corp. 0,4 нп , 25 mm) .Фильтрат используют в качестве добавок к питательным средам, В некоторых случаях белки сыворотки молока Г1|олностьк заменяют сыворотку крови фупного рогатого скота (в концентрации 10-15 %), в других случаях необ- з одимо добавление 0,5-1% сьшрротки 4рови,

Оценка пролиферативной активности клеток, растущих в питатех ькых среда белками молочной сыворотки.

Кривые роста.

: Суспензию клеток (мышиные фибро- бласты, штамм L Ifele концёнтрй.ц 1 10 клеток (мл) высаживают по кп в ячейки 24 ячеечных пластиковых Культуральных плат, инкубируют в Питательной среде Игла с 10% сьшорот Ки крупного рогатого скота в течение 3 сут. Через 3 сут ср-еду заменяют новой питательной средой, где в качестве ростовых факторов используют белки сыворотки молока или КСБ в различных концентрациях, В дальнейшем смену среды в ячейках проводят каждые 3 дня в течение 15-f6 суток. Клетки снимают трипсином (0,25%) и подсчитывают в камере Горяева

Используемые клетки растут и размножаются при культивировании их в средах, содержащих только молочную сьшоротку или КСБ в течение 15 суток ;При добавлении 1% сыворотки крови к :средам, содержащем в качестве росто- вых факторов молочную сыворотку или КСВ, темпы роста клеток выше, чем при.- инкубации их тол-ько с 10% сыво-- ротки крови КРСа Синтез ДНК о

С помощью метода проточной цито- флюориметрии (EPICp- У) изучают распределение клеток культур, расту- щих в питательных средах с белками сьгеоротки молока в качестве растовог фактора, по фазам клеточного цикла ( , ), Мьшиные фибробласты, штамм L и клетки миеломы ХбЗ - Ag 8-653 инкубируют в матрацах (исходная концентрация 8-10 клеток/мл, в среде Игла с 10% сыворотки крови) в течение 3 сут. Затем производят заме

в питат&пьной среде сыворотки крови 10%-ной сывороткой молока, В дальнейшем осуществляют смену среды, содержащей сыворотку молока, каждые три дня в течение 12 сут Для иссследо

5 О

г 0

,.

0

5

вания клетки снимают с помощью трип- ,сина, суспензию центрифугируют, отмывают средой без сыворотки, фиксируют в 70° спирта, окрашивают бромистым этидием (конц. 5 Мкг/мл, обрабатьшагот НРКазой 0,5 мгЛад. 30-мин, 25 с) . При инкубации L клеток в среде с сывороткой молока в качестве ростового фактора отмечают увеличение доли клеток, находящихся в фазе С +М, по сравнению с клетками, растущими в среде с сьшо- роткой крови.

ДНК-гистограмма культуры клеток миеломы, растущих в среде с сывороткой молока, существенно не отличается от гистограмм культур, растущих в среде с сывороткой крови в течение 9 сут инкубации в В более -поздние сроки инкубации отмечают некоторое снижение доли клеток, находящихся в фазах S и Gj+М клеточного цикла, и . увеличение - в фазе G,,

Авторадиографические исследова- нря.

Для оценки пролиферятивной активности и интенсивности синтеза ДНК- клеток культур, растущих в среде с сывороткой молока, проводят автора- диогр афическое исс ледование, С этой целью.проводят импульсную (1 ч, , 37 KBq/мл) инкубацию клеток одИосуточ- ной культуры мьппиных фибробластов (L клеток). Удельная активность 1790 TBq/моль, После этого-клетки промывают три раза физиологическим раствором, затем материал фиксируют в смеси спирта и уксусной кислоты (3:1) и высушивают на воздухе Пре-. параты покрьшают эмульсией типа М, промьгоают -1 ч водопроводной водой, обрабатьшают 5% ТХУ 5 мнн при , снова промывают водопроводной водой 2 ч и высушивают. На получен ных автографах подсчитывают процент меченных Н - тимидином клеток (на 300 клеток), Индексом меченых клеток считают отношение числа меченых к общему числу клеток, выраженное в процентах.

Из табл,1 видно, что включение ти- мидина в ДНК-клеток культур-,; растущих в среде с сывороткой молока, происходит на том же уровне, что и в ДНК- клеток, находящихся в среде с сывороткой крови крупного рогатого скота,

Дпя оценки возможности активации клеточной пролиферации покоящихся клеток в средах с белками молочной

сыворотки проводят исследования по включению Н -тимидина мышиными клетками ЗТЗ, С этой целью клетки вначале культивируют в питательной среде Игла с 10% сьторотки крови крупного рогатого скота в течение 48 ч, после чего среду заменяют на среду с 0,5% сывоотки крови, в которой инкубируют клетки 72 ч для снижения клеточной Q пролиферации.

Для. активации пролиферации покоА- щеся клетки переводят в питательную среду с 10% сыворотки молока. В качестве контроля используют питательнуюt5 среду с 10% сыворотки крови.

Из табл. 2 ВИДНО, что клетки, нахо- ящиеся в состояний сниженной пролифе- ативной активности, при переводе их в питательную среду только с белками 20 молочной сыворотки начинают синтези- ровать ДНК на высоком уровне (индекс включения 31,6% в среде с сывороткой молока и 39,0% в среде с сывороткой крови КРС) .25

Определение митотического индек- са.. . .

Клетки Helapj инкубируют в тече- ние 1 сут в пенициллиновых флаконах на покровных стеклах. Наблюдения про- 30 изводят в люминесцентном микроскопе (МЛ-2) после окрашивания клеток флюо- охромом .акридиновым оранжевым (конц. 10 М, 5 мин).

Митотический индекс как показатель с пролиферативной активности клеток определяют путем подсчета количества итозов на 1000 клеток (промилин %),

Через 1 сут инкубации клеток в среде с 10% молока+0,5% сыворотки дд КРС и в среде с 10% сыворотки КРС итотический индекс составлял 48 и 55% соответственно.

В табл.3 представлены результаты.

полученные по определению митотического индекса тех же клеток Helapj при культивировании их в питательных средах с КСБ.

Включение Зц-тимидина культурой t-fbniMHbix клеток ЗТЗ

Таким образом, по такому показателю как митотический индекс, клетки культуры, растущей в питательной среде с сывороткой молока или концентратом сывороточных белков, существенно не отличались от клеток культур, культивируемых в средах с сывороткой крови.

Формула изобретения

Способ культивирования клеток человека и животных, включающий вьфащи- вание посевного материала на питательной среде с ростовым фактором, отличающийся тем-, что, с целью уменьшения себестоимости за счет использования отходов молочной промьшленности, в качестве ростового фактора используют концентрат сьгоо- роточнь1х белков молочной сьшоротки, полученный ультрафильтрацией, или смесь концентрата сывороточных белков молочной сыворотки, полученных ультрафильтрацией с сывороткой крови крупного рогатого скота в соотношении 5-20:1..

Включение Н - клетками (Штамм L)

а б л и- ц а- 1 тимидина мьшгиными

Среда

Шщекс меченных клеток

Среда Игла

с 10% сыворотки

крови

Среда Игла 0,5% сыворотки

45 крови +

10% сыворотки молока

40,6 ± 1,9

Таблица

Изобретение относится к клеточной биологии, а именно к выращиванию клеток в культуре, и может быть использовано в вирусологии и биотехнологии для получения клеток в больших количествах. Целью изобретения является уменьшение себестоимости за счет использования отходов молочной промышленности. Для этого культивирование клеток человека и животных проводят в питательной среде, содержащей в качестве ростового фактора концентрат сывороточных белков молочной сыворотки, полученный ультрафильтрацией, или смесь концентрата сывороточных белков молочной сыворотки, полученных ультрафильтрацией, с сывороткой крови крупного рогатого скота в соотношении (5-20):1. 3 табл.

Индекс меченых клеток

44,7+0,717,9+0,9

39,013,7 31,6+3,3

715077908

Та.б лица 3

Митотический индекс клеток Helap при культивировании их в питательных.средах с КСБ

Т.

Варианты средМитотический индекс, %

Среда-Игла 10%сыворотки крови45

+1 0%КСБ + 0,5% сыворотки крови40

Среда Игла +15%КСБ + 0,5%--сыворотки крови. 40

+10%КСБ + 2% сьгаоротки крови50

.