Способ получения антигенов Советский патент 1977 года по МПК A61K39/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ

водой при щелочном рН среды экстракты мутнекгг после добавления NaC при нейтралвном или слегка щелочном рН. Эта мутность возникает из-за присутствия примесей нуклеиновых кислот. После центрифугирования обработанных рассолом экстрактов вся активность остается 8 Прозрачном верхнем слое. Верхний слой осаждают нзоэлектрически прн кислом рН около 4,8 и полученный осадок растворяют в водном фосфатном буферном растворе при рН около 7,0.

Полученный раствор фильтруют на соответствующем молекулярном сите гелевого типа в слое, позволяющем фракционировать соединемия по молекулярному весу в диапазоне от Ю-Ю до 20-10, предпочтительно 1510. Фильтрующий гель элюируют буферным раствором при нейтральном рН, при этом выделяют молекулярные фракции 10-10 до 20-10, предпочтительно 15 10.

Выпавшую активную фракцию из гелевого фильтрования растворяют в буферном растворе рН около 7,0. Полученные растворы фильтруют через колонку, загруженную слабым ионообменным молекулярным ситом типа геля со слабыми ионообменными свойствами, например полиакриламидным гелем Био-Гель Р-2, причем колонка уравновешена аналогичным буферным раствором рН около 7,0. Первая фракция, выходящая из колонки, которую выделяют, обладает антигенной активностью.

Выделенную фракцию из хроматографии на Био-Геле Р-2 подвергают особой обработке для дальнейшей очистки СРПА. Эту обработку осуществляют следующим образом. Смесь протеинов или сопряженных протеинов осаждают изоэлектрической регулировкой рН. Полученный осадок смешивают с соответствующим гелем, подобранным,исходя из имеющейся протеиновой смеси. Полученную смесь осадка и геля загружают в верх колонки, содержащей идентичный гель такого же изоэлектрического рН, т. е. рН, который является изоэлектрическим для пр.отеинов при осаждении их в предыдущей стадии. Затем колонку элюируют при постепенно возрастающем или уменьщающемся рН. В элюате выделяют те фракции, в которых .содержатся нужные протеины.

Нормальные и СРПА фракции, выделенные хроматографией, подвергают осаджению активного вещества, при рН около 5, осадок выделяют и растворяют в воде при рН около 8,5. Затем рН прозрачного раствора доводят до кислого рН около 5,0 при помощи муравьиной кислоты, такая обработка приводит к осаждению. Каждый осадок смешивают с шламом полиакриламидного геля, уравновешенного НСООН -HCOONH при рН около 5,0. Каждую из таких смесей помещают в верхнюю часть гелевой колонки, уравновещенной как указано.

Для элюирования осадков-ггри.меняют рНградиеит, и в этом случае с постепенно уменьщающимся рП. Соответствующей буферной системой является HCOOH-HCOONH и .i - NH.V Антигенная активность установлено в выходящей жидкости в диапазоне рН от начального рН ди рН 3. Выделенная

жидкость в этом диапазоне рМ содержит нужные СРПА, которые можно выделить вымораживанием. Для установления молекулярного веса СРПА этой фракции жидкости фракцию фильтруют на гелевой колонке, уравповещен ной HCOOH-HCOONl-b при рН около 3. Затем выделяют элюированные фракции СРПА со спектрофотометрическим пиком попдощения в диапазоне 229-233 мкм. и мол. вес. 20.000- 27.000. СРПА можно выделить после фильтроо вания из активной фракции вымораживанием, их можно хранить длительное время в вакууме, на холоде, в темноте.

Выделенное вещество состоит из полипептида на основе одной полипептидной цепи. СРПА имеют основную реакцию и растворимы при рП

5 I-3,5. Незащищенный полинептид денатурируется необратимо при нейтральных рП, а именно при рН 4,6. Антиген гигроскопичен, переходит в желтую окраску и становится неактивным и вязким при поглощении влаги.

Очищенные СРПА содержат флуоресцирующую группу, эта группа активируется при длине волны около 288 мкм и излучает свет при длине волны около 350 мкм. Флуоресценция пропорциональна количеству СРПА и может быть использована для определения наличия поли5 пептида при его выделении.

Спектрофотометрический пик поглощения СРПА находится в диапазоне длин волн 220 - 233мкм. Кроме того, они склонны к агрегированию и не фильтруются на нормальной фильтровальной среде, применяемой для стерилизации,

0 они не содержат углеводов и, как показывает спектрофотометрия, не содержат нуклеиновых кислот.

Выделенные СРПА можно щироко использовать, например при получении моноспецифич1 ых антител для диагностических целей, для иммунизации в качестве активного ингредиента в составах.

Пример {. Выделение чистого антигена. Карциномные и нормальные ткани из аутопсий раздельно чисто отрезают от соседних тканей и разрезают на кубики 2--3 см, эти кубики промывают в 0,9%-ном растворе NaCl при 0° С до тех пор, пока они не перестают выделять кровь. Промытые кубики замораживают и хранят при минус 24° С.

В замороженном состоянии тканевые кубики

смешивают с 10 мл воды при 0° С на 1 г замороженной ткани, затем их гомогенизируют в охлажденном гомогенизаторе. Температуру суспензии выдерживают при 0° С или несколько ниже.

Холодный гомогенат выливают в охлажденные полиэтиленовые бутылки 1000 мл. В каждой бутылке смешивают 400 мл суспензии и 400 мл этилового эфира при минус 20° С, перемешивание ведут при минус 2° С в течение 2 час в центрифуге-трясучке (300 об/мин). Смесь

центрифугируют при минус 2° С в течение 5 мин. В этой стадии липидный слой не смешивается с тканевым слоем. Этиловый эфир и липид выбрасывают и проводят вторую экстракцию в течение 1 час с последующим центр1 фугированием н теченг1е 5 мин и удаление.м

эфирлнпидного слоя.

Затем проводят центрифугирование при минус 2° С в течение 30 мин, водный слой удаляют, хотя он содержит некоторое количество СРПА. Оставшиеся нерастворимые ващества сохраняют. Оставшийся этиловый эфир удаляют вакуумом в течение 5 мин. Антигенный материал суспендируют в 50 мл воды при 0° С, переносят в инфузионные бутылки на 500 мл и замораживают при 70° С (сухой лед в этаноле). Лиофилизацию ведут в лиофилизаторе при регулируемой температуре..

Лиофилизированный тканевый порошок размалывают в шаровой мельнице при температуре минус 70° С в течение 2 час при 40 об/мин. После размола получают тонкий серо-коричневый порошок. Этот порошок экстрагируют предварительно охлажденным до минус 2° С эфиром в центрифуге-трясучке при 300 об/мин в течение 1 час и центрифугируют при минус 2° С в течение 30 мин. Эфирный слой удаляют и остаток сушат в вакууме. Полученный сырой тканевый пороиок (СТП) можно хранить годами при в гер.метичных бутылках без заметной потери активности.

Суспендируют 5 г СТП при нейтральном рН в 500 мл солевого раствора, содержащего стериальные кубики льда. Суспензию гомогенизируют, температуру выдерживают при 0° С в течение 30 мин при слабом перемешивании. Центрифугирование ведут при 0° С в течение 40 мин. Верхний слой выбрасывают. Осадок снова суспендируют в 500 мл холодной дистиллированной воды и медленно перемешивают при 0°С в течение 30 мин. После центрифугирования при 0°С в течение 40 мин верхний слой удаляют. Оставшийся осадок суспендируют в 25 .мл холодной дистиллированной воды и замораживают при минус 70° С (сухой лед в этаноле), После лиофилизации получают промытый тканевый порошок (ПТП), который можно хранить годами в герметичных бутылках при 4° С.

Приготавливают водные экстракты СРПА и нормального тканевого порошка (МТП) при рН 9,5 концентрируют их 10 раз изоэлектрическим осаждением при рН 4,8 и растворением осадка в 0,1 объема воды при рН 9,5. Полученный концентрат стабилизируют быстрым нагревом до 98-100° С и выдержкой при этой температуре в течение 5-10 мин. Такая термообработка разрушает энзимы, которые дезактивируют СРПА. Стабилизированный экстракт мутнеет после добавления солевого раствора при рН 7,5 вследствие осаждения оставшихся примесей нуклеиновых кислот. Для осаждения оставшихся примесей отдельно осаждают 8,0 мл водных экстрактов СРПА и нормальных добавлением 0,8 мл 10%-ного раствора NaCt. После центрифугирования при 0° С в течение 1 час прозрачные вер.хние слои осаждают изоэлектрически при рН 4,8 (рН регулиПют 0,1 N НС1 или 0,i N НСООН). Осадки растворяют в 2- S мл 1,150 М фосфатного буферного раствора рИ 7,0.

Питученные растворы из опухолевых и нор/n.ibrJM/ ПТП фильтруют через Био-Гель А .v м в охтаж-денных колонках. Гель уравновеа ifi-i.joT 1,{50 М фосфатны.м б ферны.м расTBopL рП 7,0 с 2/о бутанола и элюиоуют этим

же буферным раствором. В каждм.м опыте применяют 4-8 мл экстракта, солержяшего всего 50--100 мл протеина.

Антигенную активность пбнаруживаип в федней фракции, выходяним к .жидкости опухолевого экстракта. Порции но 1 мл этой фракции, всего 160-180 мл, разбавляют три раза и доводят до разных значений рП от 2,0 до 9,0. После 6 мин пребывания при комнатной температуре пробы переносят в кюветы н определяют их светорассеяния при 500 мкм пол углом 90° Зависимость интенсивности рассеивания л рП показывает максимум при рН 4.8, это значение рН является изоэлектричсской точкой этой фракции.

Оставшуюся часть активной средней фракции осаждают при рН 4,8 с помощью 0,1 N НС1. Центрифугирование при О С в течение 5 мин дает количественный выход активности.

Для дальнейшей очистки СРПА осевшие активные средние фракции из пяти колонок БиГель-А-50 М растворяют в 1/150 М фосфатном буферном растворе при рН 7,0 {буф(ф ппенсена . в2%-ном бутаноле) до 5% начя.)го жидкости. Этот раствор, содержащий 150 мл протеина в 8,5 мл фильтруют через колонку с Био-Гелем Р-2. Колонку уравновс1пивян-)1 1,150 М буферным раствором рН 7,0 (буфер

Па каждый

Соренсена в 2/п-ном бутаноле. обьем слоя протеина допускают

миллиграмм 10 мл.

Первая фракция активна, ее отводят элюирующим буфсфным раствором рН 7,0, а примеси сорбируют па геле при низкой ионной силе. Активное вещество осаждают при р11 4,8 при помощи 0,1 М HCOOI-i и центрифугируют при в течение 5 мим. Осадок рнстнорякп в 8,5 мл воды, рП доводят до 8,5 с помпшьк 0,1 М N11,ОН. Прозрачный растнор снова осаждают три раза 0,1 М ПСОО11 iifni рП 4,, промывают в центрифуге при гаком же рП и растворяют рН 8,5. Исчезновение бутанола прослеживают газо-жидкостной хро.матографией. Готовый раствор хранят в ампулах лиофилизироваины.м и замороженным. Полученный продукт представляет собой сухой, почти белый порошок, который хранят при минус 24° С в эвакуированных герметичных а.мпулах.

Для дальнейшей очистки продукта, полученного в результате предыдуи ей хроматографической обработки, разработан способ элюирования с градиентом рП. Этот способ заключается в следующем. Подлежащую очистке от активного компонента протеиновую смесь осаждают изоэлектрическим регулированием рН. Осадок сме1инвают с соответствующим гелем. Эту смесь наносят слоем в верх колонки, содержащей такой же гель с таким изоэлектрическим рН. Затем колонку элюируют с градиентом рН при постоянных расходе и те.мперагуре. Таким образо.м колонку элюируют средой с непрерывно и ступенчато возрастающим или снижающимся рП.

Градиентное элюирование н)оводят с 15 мг лиофилиз1 рованного и обессоленного порошка СРПА и нормального антигенного tiopoiuKU, очищенного указанным способи.м, в данном случае при снцж;)к)|це.1ся .чначении pli. Коротки

раилсльмо растворяют н воле, причем рИ регулируют ло 8,5 при помощи 0,1 N раствори NH,OH. Затем рИ прозрачного растиора доводят до 5,0 при помощи 0,1 М И(Х)()Н, при этом происходит осаждение. Каждый осадок смешивают с 10 мл суспензии Био-Геля , уравновешенного водным раствором 0,02 М ИСООН и 0,2 М HCOOHNH с получением рИ 5,0. Каждую из этих смесей помешают в верх колонки с 15 мл Био-Геля Р-2, обработанной силиконом. Гель находится на небольшом куске стекловолокна. Для элюирования осадков применяют градиент рН. С помощью |радиентного смесител выдерживают рН около 5 в течение короткого периода времени для промывки осадка, затем рН постепенно снижают до 2,8 и наконец увеличивают до 9,0. Буферная система состоит из 0,02 М НСООН - HCOONM, и 0,02 М N -NHj, элюирование ведут при комнатной температуре. Расход составляет 27,2 мл/см-час.

Выходящую жидкость после опухолевого экстракта анализируют флуоресцентной спект рометрией (активация при 288 мкм, флуоресценция при 350 мкм). Фракцию элюирования между начальным рН и рН около 3 выделяют для дальнейшего использования. После лиофилизации и вымораживания продукт можно хранить в герметичных ампулах после откачки воздуха цри минус 24° С.

Для характеристики размера молекулы и подтверждения чистоты антигенный материал в виде раствора фильтруют через Ьио-Гель Р-30, который уравновешивают буфером 0,02 М НСООН -HCOONH4 рН 3,0. Элюированный СРПА растворяют в небольшом количестве этого же буфера. Расход 3,25 мл/см час, собранные фракции 1,25 мл. Активные фракции показывают максимум спектрофотометрического nopvioiueHMH при длине волны 229-233 мкм и флуоресценцию при 350 мкм, если активация шла при 288 мкм.

10,4 мг СРПА, растворенные в 3,0 мл указанного буферного раствора обрабатывают на силиконизированной колонке с Био-Гелем Р-30 и получают полное выделение обоих веществ и активности. Объем элюирования сопоставим с молекулярным весом 22000-24000. После вымораживания получают белый гигроскопический порошок, который можно хранить на холоде, в темноте, без доступа кислорода. В продукте отсутствуют углеводы и нуклеиновые кислоты. Анализ при помощи аминокислот показывает соответствие с молекулярным весом, определенным по гелевой фильтрации.

Анализ аминокислот показывает следующее распределение веществ по молярным процентам с точностью до ±5%: аланин 8,62, аргинин 4,57, аспартовля кислота 10,39, цистеин 0,95, глутамовая кислота 17,04, глицин 6,87, глистидинI,О, изолейцин 4,75, лейцин 10,49, лизин 3,69, метионин 1,91, фенилаланин 2,75, промин 3,79, серин 7,74, треонин 5,92, тирозин 3,21, валин 6,36.

Содержание аминокислот соответствует теоретическому содержанию азота 16,2-17,8%.

Пример 2. Получение СРПА-альбуминового комплекса.

11г)1цмк1 С.РПА. по.пученнун) апя.киичпо примеру I, р;)ст1)орян)г в муравьиной кис.ште (мгшримгр (),0,i Л, р11 2 3). Получают n|ioзр;)чный раствор. К этому раствору добавляют порсчпюк альбумина или раствор а,чьбумина при таком же рН. как у раствора муравьиной кислоты (200 вес. ч. альбумина на I вес.ч. СРПА), и получают прозрачный раствор СРПА и альбумиия. Затем рН раствора медленно увеличивают добавлением основания (например водного

раствора едко1о натра или аммиака) до рН 7,5. Получают прозрачный раствор, содержащий СРПА и альбумин в виде комплекса.

Этот (lacTBop, содержащий 12 мкг СРП А/мл, может быть использован для диагностики или может быть В1)делен вымораживанием комплеке в виде белого порошка. Порошок стабилен на холоде (плюс 4° С) в течение длительного времени.

Максимальное использование активности достигается при весовом соотношении ильбумина к СРПА равном или больше 200:1.

Получение дубленых и меченых красных кровяных телец.

Свежую кровь овцы (1 об. ч.) добавляют к стерильному раствору Алсевера (1,2 об. ч.). Раствор Алсевера готовят из 250 г глюкозы,

80 г дигидрата цитрата натрия, 42 г NaCI и воды до 10 л, рН доводят до 6,1 при помощи КЯ/о-ного моногидрата лимонной кислоты Смесь центрифугируют и эритроциты снова суспендируют в растворе Алсевера и дважды в буферном растворе при рН 6,8.

Создают суспензию эритроцитов в буферном растворе при рН 6,8 концентрацией 10 эритроцитов в I мл на 1 объем суспензии эритроцитов, полученной как указано, добавляют при перемепшвании к I объему буферного раствора при рН 6,8, содержащему около

18 мкг дубильной кислоты на 1 мл. Дубленые таким образом эритроциты центрифугируют и дважды суспендируют в буферном растворе при рН 7,5. Далее эритроциты суспендируют в буферном растворе.при рН 7,5 концентрацией

lO эритроцитов на 1 мл.

Порцию полученного комплекса СРПА растворяют в буферном растворе при рН 7,5 и получают концентрацию СРПА 3 мкг/мл (расчитано по чистому СРПА). Добавляют 1 об. ч. суспензии дуб.пеных эритроцитов по

каплям при 0° С к I об. ч. раствора СРПА комплекса в течение 10 мин. Меченые эритроциты центрифугируют и снова суспендируют и буферном растворе при рН 7,5, содержащем стабилизирующее количество инертной человеческой сыворотки, и получают суспензию, содержащую 1,6-10® меченых клеток в 1 мл. Эти меченые клетки применяют для методики диа1ноза.

Пример 3. Получение антител.

/1ля переноса полипептидов в активном состоянии к клеткам, продуцирующим антитела, необходимо содержать полипептиды в раствор при рП ниже 3 (0,02 .М НСООП, рП 2,8) и эмульгировать раствор в масле до обргшоипния чрезвычайно малых капель, защишсппьк сяо ем масла. Инъекция такой эмул1 сии прниилш

к обрпзоняпию удов,,1рительного ко.щчсп 9, ва антител, которые специфичнореагируют с СРПА н реакциях склеивания красных кровяных телец, в которых клетки крови мечены СРПА. Получение иммунизирующего реагента. 816 мкг чистых СРПА, полученных из хранящихся раковых опухолей человека, растворяют в 1 мл 0,02 М НСООН при рН 2,8. К этому раствору по каплям добавляют 1,0 мл вспомогательного масла при эмульгировании. Эмульгирование ведут по Фройнду шприцем для инъекций. Смесь втягивают и вьшускают из шприца до образования гомогенной эмульсии белого цвета, имеющей консистенцию взбитых сливок. Одна капля этой эмульсии при испытании с ледяной водой отдельно плавает и остается неповрежденной. Полученную полутвердую эмульсию применяют для подкожных и внутримышечных инъекций кроликам. Иммунизация пяти кроликов. В первой инъекции применяют, так называемое полное вспомогательное вещество, а в последующих инъекциях, неполное вспомогательное вещество. После начального отбора крови у каждого из пяти кроликов для установления О - величин, им подкожно вводят справа и слева по 408 мкг эмульгированных СРПА при рН 2,8. С интервалами в десять дней вводят еще три инъекции, первую внутримь1шечно в задние лапы, а вторую и третью соответственно в переднюю и заднюю часть.. Выбирают место инъекции, исходя из использования приемных участков региональных лимфатических желез. Всего каждый кролик получает около 1,6 мкг СРПА в виде эмульсии. Через 14 и 24 дня после последней инъекции берут пробы крови для анализа на склеивание красных кровяных телец для определения наличия специфичных антител против СРПА. Через два дня после отбора последней пробы спускают максимальное количество крови, выделенной в виде сыворотки, которую стерильно фильтруют и переносят малыми порциями в стерильные пробирки. Эти пробирки можно хранить на холоде при поддержании специфических условий. Процедура диагностики. Анализ крови основан на показании наличия СРПА по модифицированной методике подавления слипания красных кровяных телец {микрометод). Сыворотку пациента (25 мкл), сорбированную красными кровяными тельцами овцы, титруют в восемь стадий двумя разбавлениями в разбавительных пластинах Линдро 15 MQ С - 96, затем в каж дую полость добавляют 25 мкл специфичной иммунной сыворотки при предельном разбавлении (1:2000). После инкубации при 22° С в течение 10 мин в каждую полость добавляют по 50 мкл суспензии около 6-8 миллионов красных телец крови овцы, задубленных и меченных выделенными СРПА, комплексированными с человеческим альбумином (2-4 мкг на 10 клеток крови). Вместо эритроцитов можно применять другие порошкообразные носители, например латекс, бентонит или коллодий. Реакцию записывают при помощи наклонного зеркала и стандартной серии через 4-24 час после инкубации при 1 -2° С. 42 Для контроля применяют: а) клетки крови, меченные СРПА, плюс иммунная сыворотка; б) клетки крови, меченные СРПА, без иммунной сыворотки; в) сыворотку больного плюс клетки крови, меченные человеческим альбумином; г) сыворотку больного и необработанные клетки крови; д) клетки крови, меченные СРПА, и антитела в одной серии, где ингибирование обеспечено ступенчатым уменьшением известных количеств СРПА. Жидкости для разбавления содержат соединенную от многих людей инактивированную нейтральную сыворотку для стабилизации клеток крови. Реагент СРПА получают из хранящихся раковых тканей человека, очищают его с помощью гелевой фильтрации, элюирования рНградиентом, фильтрованием через Био-Гель Р-30 и комплексированием с альбумином. В качестве иммунной сыворотки применяют лошадиную анти-Не-La, сорбированную нормальной тканью, и запасную человеческую сыворотку. Иммуннизацию проводят промытыми с}рагментами He-La клеток, выращенных на среде Игла, содержащей инактивированной человеческой сыворотки в плоских стеклянных бутылках. Клетки собирают с помощью ЕДТА, центрифугируют и три раза промывают водой. При наличии в сыворотке большого СРПА лощадиные антитела нейтрализуются, при этом не наблюдается склеивания при последующем добавлении клеток крови, меченных полипептидами. Регистрацию ведут по.возрастающей шкале от О до 6, где О указывает на отсутствие ингибирования, а 6- на максимальное ингибирование склеивания. Записи делают без учета состояния здоровья больного. Статистический анализ экспериментальных данных показывает, что существует важная зависимость между диагнозом рака и увеличенной концентрацией СРПА (Р 0,001). То же относится к соотношению между размером массы рассматриваемой опухоли и увеличенной концентрацией СРПА (Р 0,001). Независимо от типа и локализации установлено, что раковые опухоли содержат СРПА, вследствие чего СРПА являются общими для всех типов рака, т. е. злокачественных опухолей эпителийного происхождения. Формула изобретения Способ получения антигенов путем обработи гомогенизированных ткалей органическими астворителями, лиофилизацией осадка и повторной гомогенизацией его при низкой температуре с последующим гидролизом гидрокисью натрия, обработкой хлористым натрмем, саждением в и/сэлектрической точке и растворением осадка в буфере, отличающийся тем, то, с целью повышения специфичности антигенов, растворенные в буфере белки фииьтрут через гель собирают фракции моя gee. 10-10 --20-10 U повторно фильтруют через ель, собирают первую активную порцию, доводят до мол. вес. рН около ,,581842,2 рН 5,и, соединяют осадок с гелемгелем, элюируют растворами со снижающимся 2.000 ypaBFioBeiiieHHHM буфером приf радиентом рН и собирают фракцию, элюируе5,0. помещают на колонку с тем жемую при рН 3,0,