Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к интерферону типа омега Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридом- i ной технологии и может быть использовано при получении монАТ к интерферону типа омега.

Способ осуществляют следующим образом.

Селезеночные клетки животного, прошедшего предварительную иммутизацию интерфероном типа омега или гибридным интерфероном, состоящим из одной части интерферона типа омега-1. и одной части интерферона типа альфа, предпочтительно интерфероном типа омега-1 или интерферонами типов омега- 1 и альфа-х и последующую дополнительную иммунизацию интерфероном типа омега, предпочтительно интерфероном типа омега-1, подвергают слиянию с миеломными клетками, которые предпочтительно сами не продуцируют антитела, например с миеломными клетками линии P3X63Ag 8,653.

Получаемые при этом гибридомные культуры подвергают скринингу с целью идентификации тех клонен, которые .: продущ руют направленные против интерферона типа омега моноклональные антитела (монАТ). Ятя этой цели, например, исполвзуют биологические опыты, которые могут подтвердить

О

ю

со (:о со

ы

внзывne fyro полученными яптитепами 1тейтп.-1лизаци ю биологических активностей интерферона типа омега., например антивирусной активности„

Из напученных по способу хгяти культур, которые обозначают как ОИГ-4 , , ОМГ-6, ПМГ-7 и ОМГ-8 - и которые проявляют существенное уменьшение антивирусной активности интерЛерона типа омега-1, выбирают клоны ОМГ-4, ОМГ-5 и ОМГ-7, которые используют для произволсгва монАТ. Для этой цели выбранные линии гиб- ридомных клеток культивируют in vivo или in vitro. Клетки выбранных клонов инокулируют в мьпией породы Balb/.c, которым предварительно вводят пристан или неполную среду Фройн да. Через 7-18 дней собирают асцит- ную жидкость, из которой монАТ вьще- ляют путем осаждения сульфатом аммония и последующей аффиной хроматографии или же- другими известными методами. Образовавшиеся антитела можно также только обогащать в ос- цитной жидкости.

Образовавшееся антитело можно аналогично обогащать или же выделять из насадочной жидкости соответствующей клеточной культуры, подготовленной in vitro. Получаемое по способу монАТ можно использовать не только для доказательства наличия интерЛерона типа омега, но и для очистки интерферона типа омега, предпочтительно интерферона типа омега-1.

Если получаемое монАТ предназначено для тонкой очистки интерферона ти омега, то его предпочтительно ко- валентно связывают с биологически неактивным носителем. При этом кова лентная связь антитела осуществляется на соответственно активированном носителе, предпочтительно Hai декстр новой основе, например, на активированной бромистым цианом или группой СН сефарозе. При этом подлежа- 1ЧИЙ очистке интерферон типа омега, например омега-1, в виде раствора пропускают над полученным монАТ на носителе при слабооснойной величине рН, например при рН 7-8, предпочтительно 7s, 5, после чего промывают при рН 7,5 до тех пор, пока Ьлюат больше не содержит протеина. Затем связанный интерферон элюируют в кислой области, например, при По

мощи Ojl М лимонной кислоты в 25%- ном этиленгликоле. Получаемые таким образом содержар1ие протеин фракции подвергают хроматографии на сильнокислом катионите, например, на ка- тионите Моно-С, При этом человеческий интерферон в упомянутом элюате немедленно абсорбируется катиони- том и затем элюируют при помощи градиента хлористого натрия.

Если монАТ используют в качестве антигена для доказательства наличия или для количественного определения интерферона типа омега, то можно использовать общеизвестные методы с использованием иммунопроб.

Пример 1, Получение моно- клональных антител, специфических относительно интерферона типа омега.

Иммунизация,

Самку мьппи типа BaLb/c возраста около восьми недель подвергают иммунизации высокоочш енным (степень тистоты 95%) гибридным интерфероном типа омега-1/о62 следующим образом. Первая иммунизация: 200 мкг указанного интерферона вместе с полным адъю- вантом Фройнда (внутрибрющинно), вторая иммунизац тя: 200 мкм указанного интерферона вместе с полным составом добавки Фройнда (внутрибрюшинно), Вторая иммунизация осуществляется по истечении 5 недель после первой иммунизации.

0

По истечении восьми недель после второй иммунизации мышь подвергают дальнейшей иммунизации с помощью 70 мкг очищенного интерферона типа омега-1 (степень чистоты 90%) при использовании неполного адъюванта Фройнда (внутрибрюшинно), Через 12 дней берут прабу сьгооротки.. Опыты по нейтрализации показывают, что сыворотка мьшш имеет относительно высокие титры нейтрализующих антител против интерферона типа омега-1 (полная нейтрализатщя при разбавлении сыворотки до 1000-кратного, частичная нейтрализация при 1000-кратном разбавлении). Опыт по нейтрализации осуществляют следующим образом: 100 мкг разбавленной пробы сыворотки в среде клеточных культур

смешивают с 100 мкг раствора интер- - Ферона типа омега-1 (100 антивирусных ед./мп) и в .течение 90 мин инкубируют при .Затем антивирусну активность проб определяют биологичеким методом с использованием клеток А549 рака легких, инфицированных ри русом энцефало-миокардита. Через 5 недель после третьей иммунизации мышей еще раз инт едируют 70 мкг очищенного интерферона типа омега-1 (степень чистоты 90%) без добавки.

Получен ие и скрининг гибридом.

Получение гибридом осуществляют при использовании несецернируюгщх клеточных линий P3X63Ag8.653. По истечении 4 дней после последней иммуниза1щи берут селезенку мыши; клетки селезенки механически удаляют из ткани, суспендируют в среде для клеточной культуры (среда: RPMI 1640 с добавкой пенициллина в виде натриевой соли; 100 ед/мл) и стрептомицина в виде сульфатной соли (50 ед/мл) и центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин в центрифз ге типа Бекманн TI-6. 2х1П миеломных клеток (культивированных в упомянутой среде с добавкой 10% эмбриональной телячьей сыворотки) собирают центрифугированием и пром1 вают один раз бессывороточной средой для клеточной культуры. Клетки селезенки и миеломные клетки затем повторно суспендируют в бессывороточной среде для клеточной культуры, суспензии . соединяют и повторно центрифугируют. Недостаточную жидкость удаляют, клетки суспендируют в 3 мл сред1,1, состоящей из 45% среды RPMI 1640, 50% полиэтилен гликоля с молекулярным весом 4000 и 5% диметилсульфокс1ида, и в течение 90 с осторожно встряхивают. Затем оставляют стоять в течение 60 с. В течение 90 с по каплям прибавляют 3 мл бессыворлточной гтита- тельной среды, суспензию в течение 60 с оставляют стоять, затем по каплям в течение 90 с добавляют Дальнейшие 6 мл 6ecciiiBopoTo4no4 питательной среды и, наконеп, постоянно пе- ремеигивая, медленно прибавляют 12 мл питательно) среды с 10% эмПриональ- ной телячьей сыворотки, оставляют стоять в течение 10 мин и затем доводят до объема 50 мл добаялением среды для клеточной культуры с 10%

1602393

0

эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 40П мл среды ГАТ (с 2 добавкой 20% эмбриональной телячьей сыворотки, гипоксантина 1,., ам1 ноптерина 4x10 М и тимидина 1,6x10 М) . К этой суспензт-га прибавляют перитонеальные макрофаги из 10 мышей пород1 1 BaLb/c (приблизительно 50000 кл./мл).

Суспензию пипеткой подают на плас- . тинки, каждая из которых снабжена 5 48 углублениями (каждое углубление имеет ем1 ;ость 0,5 мл). Пластинки инкубируют при 37°С (95% воздуха, 5% двуокиси углерода, насыщение .во- )дяным паром). По истечении трех дней к каждой культуре прибавляют 0,5 мл среды ГАТ. Из всего 800 исходных культур по истечении 2-3 недель приблизительно 300 культур показьюа- ют рост гибридомных клеток. Последую- скрининг осутцествляют следующим образом.Над осадочные жидкости по меньшей мере 10-20% слитых гибридомных культур смепмвают с одинаковым объемом раствора человеческого интер- 0 ферока типа омега-1 (20 антивираль- ных ед./мп), нркубируют в течение 90 мин при 37 с и затем исследуют по меньшей мере два раза с соблюдением промежутка в одну неделю. 5 из куль- 5 тур, которые далее обозначаются как ОМГ-4, ОМГ-5, ОМГ-6, ОМГ-7 и ОМГ-8, во всех опытах всегда проявляют уменьшение антивирусной активности. Все культуры клонируют путем лими- тирую1чего разбавления и клоны снова исследуют на нейтрализующую активность. Из каждой культуры 3-5 положительных клонов подвергают дальней0

inefi обработке. Для пол Чения антител на живом организме 3-10x10 клеток каждой гибридной культуры внутрибрю- 1 й-;нно инокулируют в мыши породы Balb/c, которым за 2-3 дня до этого внутрибрюшинно инъецируют 0,5 м.п неполного .адъюванта Фройвда или за 7-10 дней до этого - 0,5 мл приста- на. По истечении 7-21 дня собирают образовавшуюся астц-гтную жидкость. Содержащиеся в ней антитела обога- .-цают до степени чистоты выше 90% путем осажг;ения 50% сульфата аммония и а(хЬинной хроматографии на связанном с носителем протеине А. Для всех гибридом на 1 мл асцитной жидкости получают приблизительно 2-5 мг чистого антитела.

Характеристика антител ОМГ-4, OJIT-S и ОМГ-7.

При электрофорезе на полиакрила- милном геле с использованием доде- иилсульФата натрия, проводимом в невосстанавливаю1п 1хся условиях, и жидкостной гель-хроматографии под -to давлением все антитела проявляют удерживаклцую характеристику, идентичную с иммуноглобулином R. В опыте по нейтрализатщи, в котором исследуют торможение.антивирусной активности 5 интерферонов, все антитела в концентрации 100 микг/мл нейтрализуют активность интерферона типа омега-1, но не активность интерферона типов льфа-2с, бета и гамма. Выше указан-2о ные клоны депонирапгЧны под номерами 87081404 (ОМГ-4), 87081402 (ОМГ-5) и 87081403 (ОМГ-7) в European Collection of Animal Cell Cultures. Centre for Applie d Micro- 5 biolof y and Research (Великобритания) . Пример 2. Анализ с использованием связанной с энзимом пробы для определения ин-зо терферона типа омега-1.

Антитела ОМГ-5, и ОМГ-7 ковалент- но связывают с пероксидазой из хрена. Для этого 2 мл пероксидазы в воде -j сметивают с 0,2 мл 100 мМ перйодата натрия, встряхивают при комнатной температуре в течение 40 мин и подвергают диализу при 4 С в течение ночи при рН 4,4 с исполвзованием дО 2x500 мл 1 мМ ат1етата натрия. Затем раствор доводят до рН примерно 8 добавлением 0,1 Н бикарбоната натрия с рН 9,5, К раствору добавляют раст,- вор. моноклонального антитела (ОМГ-5, дз 2 мл с 1,6 мг/мл; или ОМГ-7, 1,5 мл с 4,7 мг/мл, каждый раз в 10 мМ бикарбоната натрия с рН 9,5), после чего встряхивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляют CQ 100 мкл раствора бората натрия (4 мг/мл ввода) и раствор инкубируют на ледяной бане в течение 2 ч. Яа- тем по каплям добавляют 3 мл холодного насыщенного раствора сульфата аммония и инкубируют на ледяной ба- не в. течение 1 ч. Образовавшийся оса- дов, связанный с пероксидазой иммуноглобулина, собирают ггутем центри55

з Q

5

фугирования, растворяют в содержагцем фосФатньпЧ буфер изотоническом растворе поваренной соли с рП 7,4 и стабилизируют путем добавления t мл- раствора альбумина сыворотки крупного рогатого скота (10 мг/мл в содержащем фосфатный буфер растворе поваренной соли). Получаемый раствор замораживают при минус 70°С.

Определение интерферона типа омега-1 с использованием связанных с энзимом иммунопроб на твердом носителе осуществляют следуюпщм образом. Для покрытия пластинок используют антитела ОМГ-2, ОМГ-5 или ОМГ-7 в концентрации 10 мкг/мл в 0,1 М карбоната натрия с рИ 9,5 (100 мкл на углубление) и пластинки инкубируют либо при комнатной температуре в течение часа, либо при 4-8°С в течение ночи. Раствор антитела уда1шют, углубления промывают 200 мкл воды и заполняют 100 мкл раствора альбумина сыворотки крупного рогатого скота (5 мг/мл) в Содержащем фосфатный буфер изотоническом растворе поваренной соли с рН 7,4 (далее раствор АС/ПС). Затем добавляют 100 мкл раствора интерферона типа омега-1 с концентрацией 20 нг/мл и перемешивают. Затем во все углубления подают 50 мкл раствора, связанного с энзимом антитела (ОМГ-5/пероксидаза или ОМГ-7/пе- роксидаза), (раствор разбавлен в соотношении 1:10000 в АС/ПС) и пластинки инкубируют при комнатной температуре в течение 3ч. Затем раствор удаляют, углубления трижды промывают водой и заполняют 100 мкл субстратного раствора (3 мг/мл о-фени- лендиамина, 1 мг/мл пербората натрия в 0,067 М нитрата калия, рН 5). Через 30 мин инкубации при комнатной температуре в каждое углубление пипеткой подают 100 мкл 4 н серной кислоты, после чего замеряют оптическую плотность-при 492 нм. При всех исследуемых пробах (используемое для покрытия антитело и связанные с пе- роксилазои антитела) достигаются зависяп ие от дозы изменения абсорб- 1ЩИ. Для выполнения покрытия также используют 10 мкл/мл иммуноглобулина против интерферона типа омега-1, полученного путем двукратной имму- низации кролика интерфероном типа омега-1 и частичной очистки из сыворотки осаждением 50%-ным сульфатом

аммония. Анализ с использованием связанной с энзимом пробы можно использовать не только для количественного определения интерферона типа омега-1, но и, например, для определения содержания типа омега-1 в летЧкоцитарных интерферонах или других интерфероновых -препаратах, полученных из клеточньпс культур.

П р и м е р 3. Определение интерферона типа омегапутем иммунометрии

Антитело ОМГ-7 известными приемами маркируют системой N-сзтсцинимидил (2,3 н) пропионат (далее: H-NCn : 110 Ci/ммоль), Для этой цели в сили- конизированной емкости в вакууме сушат досуха 1 мС1 раствора H-NCJI.

чего трижды промывают 250 мкл воды. Затем добавляют 200 мкл раствора маркированного антитела (100 нг/мл в АС/ПС; на трубку примерно 27000 имп/мин) и инкубируют при в течение 20 ч. Затем шарики трижды промывают 20 мкп воды, переводят в полипропиленовые трубки и добавляют 4 мп сцинтиллирующей среды, после чего замеряют связанную радиоактивность. Использование изобретения позволяет получать монАТ высокой специфичности к интерферону типа омега.

Формула изобретения

Способ получения гибридомы, про- дуцируюп ей моноклональные антитела

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении МОН АТ к интерферону типа омега. Животное MUS MUSCULUS L. подвергают двукратной иммунизации гибридным интерфероном - 1 ч. интерферона типа омега-1 и 1 ч. интерферона типа α-2 и затем двукратной иммунизации интерфероном типа омега-1. Полученные иммунные клетки селезенки культивируют в сывороточной среде для кисточной культуры. Получают миеломные клетки линии Р3Х63 AG8,653. Клеточные культуры раздельно промывают и суспендируют в бессывороточной среде для клеточной культуры. Суспензии объединяют, суспендируют, осадок суспендируют в среде, содержащей 45% RPMJ 1640, 50% ПЭГ и 5% ДМСО, суспензию встряхивают, добавляют бессывороточную среду для клеточной культуры, а затем среду с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Смесь центрифугируют, осадок суспендируют в среде с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, гипоксантином, аминоптерином и тимидином. В суспензию вносят перитонеальные макрофаги, инкубируют и отбирают целевой продукт.

Затем пипеткой добавляют 50 мкг раст-2Q к интерферону типа омега, заключаювора мон AT Of ir-7 (4,7 мг/мл) в содержащем буфер растворе поваренной соли с рН 7,4 и 3 мкл 1 М боратно- го буфера с. рП 8,5. По истечение 24 ч при 4°С избыточны H-NCIT уда.т1яют 25 20 мкл 1 М глигщна в боратном буфере, разбавляют 250 мкл 50 мМ калий-фосфатного буфера с рИ 7,4j 150. м11 хлористого натрия и 5 мг/мп альбумина сыворотки крупного рогатого ско- ЗО та и отделяют от маркированного антитела путем хроматографии на колонке (0,5x20 мс), содержащей сефадекс G 50 М, Антитело показывает специр |1йся в том, что животное Mus.mus - culus L. подвергают двукратной иммунизации гибрид1№1м интерфероном, состоящим из 1 ч интерферона типа омега-1 и 1 ч, интерферона типа о6-2 и затем двукратной иммунизации интер фероном типа омега-1, полученные иммунные клетки селезенки, предварительно прокультивированные в сывороточной среде для клеточной культуры, и миеломные клетки несецернирующей линии РЗХбЗАр, 8,653 раздельно промывают и суспендируют в бессывороточ- ной среде для клеточной культуры.

фическую активность примерно 10 Ci/r 5 суспензии объединяют, центрипротеина. Для осуществления опыта протравленные полистирольные шарики диаметром 6,5 мм снабжают покрытием из антитела ОМГ-2 (10 мкг/мл в О,1 М карбоната натрия с рН 9,5; 1 ч при комнатной температуре). -Шарики подают в раствор АС/ПС, инкубируют в трубках в течение часа и затем два раза промывают 250 мкл воды. К шарикам добавляют 200 мкл раствора интерферона типа 6мега-1 в повышаю- прхся концентрациях в АС/ПС, инкубируют при 4°С в течение 3 ч, после

фугируют,осадок суспендируют в среде, содержащей 45% RPMI 1640, 50% полиэтиленгликоля и 5% диметилсуль- фоксяда, суспензию встряхивают, до- до бавляют бессывороточную среду для кл точной культуры, а затем среду с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, центрифугируют, осадок суспендируют в среде с 20% эмбриональной телячьей 45 сыворотки, гипоксантином, аминоптери ном и тимидином, в суспензию вносят перитонеальные макрофаги мышей, инкубируют и отбирают целевой продукт.

р |1йся в том, что животное Mus.mus - culus L. подвергают двукратной иммунизации гибрид1№1м интерфероном, состоящим из 1 ч интерферона типа омега-1 и 1 ч, интерферона типа о6-2, и затем двукратной иммунизации интерфероном типа омега-1, полученные иммунные клетки селезенки, предварительно прокультивированные в сывороточной среде для клеточной культуры, и миеломные клетки несецернирующей линии РЗХбЗАр, 8,653 раздельно промывают и суспендируют в бессывороточ- ной среде для клеточной культуры.

фугируют,осадок суспендируют в среде, содержащей 45% RPMI 1640, 50% полиэтиленгликоля и 5% диметилсуль- фоксяда, суспензию встряхивают, до- бавляют бессывороточную среду для клеточной культуры, а затем среду с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, центрифугируют, осадок суспендируют в среде с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, гипоксантином, аминоптери- ном и тимидином, в суспензию вносят перитонеальные макрофаги мышей, инкубируют и отбирают целевой продукт.