Способ получения собачьего @ -интерферона Советский патент 1991 года по МПК C12N15/20 

Изобретение относится к биэтех-актирчосгью, в частности к способу

нологии, а именно к способу получе-получения собачьего , нтеоферона

ния веществ с антивируснойформулы

1 J1C 15

су г ни UK

ТСС СЛО CTG

fop /AS fy (ft, Atf Ач V Лгу ft L&

:СО GAC ЛСС САС W}C CTЈ С.; АЛС TLU GI J CTGиц

CTG20

Пг UK teu ty с fa Met Агд лгл J.fu Set № Сеу set yf fop

ЛСО СТО CJTG- A GAG AT AGO A iA ( TC TOO #,4, CWO Т С Т TG1. C

и к способу

нтеоферона

15

L&

CTGиц

О. О

ю о ю

OJ

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения веществ с антивирусной активностью. Печень собаки инкубируют в буфере с PH 8,0, экстрагируют ДНК с использованием фенола, диализа и осаждения этанолом, ДНК центрифугируют, диализуют и осаждают этанолом. Полученную ДНК длиной более 50 т.п.о. частично переваривают эндонуклеазой SAU 3А, фракционируют по величине путем электрофореза и выделяют фрагменты длиной 10 - 23 т.п.о., которые после дефосфорилирования клонируют в LAMBDA=EMBL 3 (-3А). ПОЛУЧЕННУЮ БИБЛИОТЕКУ ГЕНОВ СКРИНИРУЮТ С ПОМОЩЬЮ РАДИОАКТИВНО МАРКИРОВАННЫХ ИНТЕРФЕРОНОВЫХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА, ВЫДЕЛЯЮТ ГОМОЛОГИЧНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК, субклонируют их в векторе PUC 9 и вводят в экспрессирующие плазмиды. Полученными при этом векторами трансформируют штамм Е. COLI с последующим выделением конечного продукта. Выход целевого продукта составляет не менее 3^.10⁵ ед. активности интерферона на 1 л культуральной среды.

35

Hi Цъ Ъг V M Ma p/,t e&, u« p/,e &fl c-fy

;лс ГАС AI.O /AT GAG ттт вис ттс исо лл ш иго-m iwt

40

Гт

50

et, Ы b Ah G № leu Sei VnC Vat His, faf Nd

слЈ COG CTC ела ела ош ало- ссс ото тот ста атс с АС отс ATG65

rtt, Си ty5 ЮЈ Ate Cyi &. Jefc Afo

лее ела AAG с-тс ттс слс сто ттс тсс CCG GAC АСс тсс тот ост

80

А« /V Ш fat П г- kv ictf fa ССи /.ы fy 6fy tttf

ССТ ТСО ЛАС-АТС- ACT CTC CTG GAC- СЛЛ СТО ТОО TCG- OCG- CTC TCT

95

№ G-Cu ie« 4s/ hp kv C& № fys fa te. Г4 № Cfy

GA(3- CAU- СТО C-AT CAC CTG- G-A CCC TC-T CCC СТО СЛО ОЛ& COG COO110

itn СЬ Tin- h № fo СЬ АФ & rtt fy 7f4

CTC CCC GAG- ACC CCC CTC ATG CAT CAC- ТСС ACC CTG- AGG ACC

125130135

fn Me № 9 C1 btt tyi kn Щ, 4s/ J# AshUz Set

TAG ТТС САА AW АТС ТСС CTC TAG CTC- СЛЛ С-ЛС AGG- ЛАС СЛС ACC WOI ;i 5150

A fy № f C&, Met Volfy Ав ев, № Qgy Ay A fl/,e

CCG TUT GCC TOG MG ATG (iTC CGA CCA СЛЛ АТС GOG- AGJ ТСС ТТС

165

Гз5

1GO

fht ut Sf П % & hj Щ fy Ay AyLy +

ттс тсс TCO AC: л АТС тто с АЛ G-АЛ ло-л АТС AUG AGO AGG AAA тал.

Способ получения собачьего интерферона заключается в том, что собачью печень инкубируют в присутствии буфера с рН 8,0 с последующей экстракцией с использованием фенола, диализом и осаждением ДНК этанолом, которую в присутствии буфера центрифигируют с последующим диализом и осаждением этанолом, полученную при этом ДНК с длиной более 50 кб подвергают частичному перевариванию эндонуклеазой Sau ЗА в присутствии буфера с рН 7,5 с последующим фракционированием по размеру путем электрофореза и выделением фрагментов с длиной 10-43 кб, которые по60

70

75

85

90

100

105

115

120

1GO

сле дефосфорилирования клонируют в лямбда-векторе Lambda-EMBL3 (-3A), с последующим умножением, полученную ген-библиотеку ДНК подвергают скринингу

с помощью радиоактивно меченых интерфе- роновых генов человека с выделением гомо- логичных последовательностей ДНК, которые подвергают субклонированию в векторе pUC9, с последующим умножением

и введением в экспрессирующие плазмиды, и полученными при этом векторами трансформируют E.coli с последующим выделением конечного продукта.

Пример. Выделение ДНК собаки.

Замороженную ткань печени собаки размалывают в жидком азоте до тонкого порошка и в течение 3 ч при 55°С, инкубируют в 0.5 М этияендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,5% додецилсульфата натрия (ДСН), 0,1 мг/мл протеиназы К (20 мл/г ткани). Полученный вязкий раствор освобождают от белка путем экстракции фенолом и трехкратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), диализуют в буфере 5 мМ трис- HCI, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCI и ДНК осаждают двумя объемами этанола, После полного высушивания в вакууме ДНК растворяют в ТЕ-буфере (10 мМ трис-HCI, рН 8 0, 1 мМ ЭДТА) при 4ЬС и вместе с 1.273 г CsCI/мл раствора центрифугируют в течение 62 ч при 20°С со скоростью 20000 об/мин. После удаления хлорида цезия фракции, содержащие ДНК диализуют в ТЕ-буфере и затем ДНК осаждают двумя объемами этанола, промывают 70%-ным этанолом, высушивают и снова растворяют в ТЕ-буфере (4°С).

Готовый ДНК-препарат свободен от РНК и имеет длину более 50 т.п.о. (определено путем электрофореза в 0,45%-ном ага- розном геле).

Частичное переваривание лчцонуклеа- зой и фракционирование по величине ДНК собаки.

50 мкг ДНК инкубирую пр 1 37°г с 2,0 ед. Sau ЗА в 450 мкл реакционной среды-(1C мМ- трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ МуС12, 1 мМ дитиотреигопа). Через 40 и 60 мин отбира ют 225 мкл и свешиваю с 15 мМ ЭДТА и путем нагмеьания до а течение 10 ин прекрс а,г or реакцию Добавляют ацетат натрия до концентрации 0,3 М, рН 6,0, ДНК осаждают добавлением 2.5 объемов зганолонз. После растворения в ТЕ-буфере ДНК разделяют по селичине электрофорезом в течение ночи в 0,-,5%- ном агарозном геле в ТВЕ-буферо V10,8 г/л трис-HCI, 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л (ЫэаЭДТА) примерно при В/см При помощи маркеров (переваренная с помощью EcoRI и Hind IM и переваренная с момощью Hind Ml лямбда-ДНК) вырезают кусок геля с ДНК длиной 10-23 тысяч пар оснований (далее т п.о) ДНК электроэлюируют из геля в течение 3 ч при 300 3 в камере для диализа (буфер 0,1хТВЕ), очищают хроматографией на колонке Элютип Д и осаждают этанолом. Дпя того, чтобы предотвратить самолигиро- вание фрагментов ДНК, которое может привести к искусственным гибридам последовательностей собачьей ДНК и к CMituKO большим и таким обоазо более

5 неспособным упаковываться в лямбда-фаги ДНК-кускам, расфракционировэнные по величине фрагменты ДНК дефосфорилируют. Для этого ДНК инкубируют в течение 30 мин при 37°С в 140 мкл реакционной среды (50

0 мМ трис-HCI, рН 9,5. 10 мМ MgCl2, 0,1 мМ ацетата цинка, 1 мМ спермидина) вместе с

5ед. фосфатазы из кишечника теленка, добавляют следующие 5 ед. фермента и инкубируют 30 мин. После добавки ЭДТА до

5 конечной концентрации 25 мМ ДНК экстрагируют однократно с помощью смеси фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (2524:1 по объему), двукратно с помощью смеси хлороформа с изоамиловым спиртом

0 (24/1 по объему) и трехкратно с помощью диэтилового эфира, осаждают этанолом, высушивают и растворяют в 0,1х7Е-буфере.

Построение библиотеки геномной ДНК

5 собаки.

Дефосфорилированные длиной 10-23 т.п.о. фрагменты ДНК собаки клонируют в лямбда-векторе, например Лямбда-ЕМВ1 -3 или -ЗА с G-A-T-C-липкими концами, пол0 ученными путем удаления внутреннего BamHI-фрагмента фаговой ДНК.

Вектор выращивают в штамме E.coll с супрессорным фактором SupF напрммчр, F eel НЭД526 538 ити 539, в содержащем 5

5 мМ м -тгния LB Ь/пьоне (10 г/л тритечч, 5 г/л ,го эхсграюа и 5 г/л ллэристон) матриц осаждзют полиэти- леягпиколем и очишакг путем двугоа.ного ировачия в гра ..- плотности

0 (0 г .-(.тчопа, 0 ч, РОГО

06 мин ). Пссгг диализа против тс бу- нра Фаговую ДНК огзоГ цают от белка ,; /тем доукратной э. iракиии смесью фенола с х орофпрмом и изоамиловым гпиоюм

5 (25/24/1 по о&ьек и дв сяжой экстра месью хлорозе с изоамиловым .-piuM I24/ , по обьему , конце,- трируюч ссажде ий этаюпгм.

Для получения конечных фрагментов EWBL ЗА GO мкг фя овой Д)fК в течение 2 rif-.i в -15 MX/ реакционной среды (1C м У1 7рис-НС рН 7,5, 10 мМ MgCb. 1 мМ д 1Г -ютреигола} полностью теревар ваю-- с помощью Вяп 1 (1 с HL.-I щью 15 мМ ЭДТА в

) ггч. 10 мим при 70°С прек{.-лщ,тют резкДИЮ L ДНК СЗЯЖДоЮТ JldHC ПОМ

избежание обрит icro легирсьэнил средний фрагмент дополнительно разрезают „, помощью EcoRI и отделенный ояито- нуг 1еотид удаляю, путем осаждения изспропанолом, При этом переваренную Взгг.Н лямбда-ДНК полностью переваривают CcoRI a 2 ч при 37°С в 450 мкл 10 М грис-HCt, рН 7,5, 100 мМ NaCI, 10 мМ

MgClz, реакцию прекращают путем добавки 15 мМ ЭДТА и 10 мин нагревания до 70°С. После добавки ацетата натрия до конечной концентрации 0,3 М три больших фрагмента ДНК осаждают с помощью 0,6 объема изо- пропанола в течение 15 мин при 0°С, промывают два раза 0,45 М ацетатом натрия и 0,6 объема изопропанола и однократно 0,3 М ацетатом натрия и 2,5 объема этанола и растворяют в 15 мкл 0,1хТЕ-буфера. При этом BamHI/EcoRI-линкеры остаются в растворе. EMBL ЗА-фрагменты (8 мкг) объединяют с 5 мкг ДНК собаки длиной 10-23 т.п.о. и 10 ед. Т4-ДНК-лигазы и инкубируют в течение ночи при 14°С и один день при 4°С в 50 мкл буфера для лигирования (66 мМ транс-HCI, рН 7,2, 0,1 M,NaCI, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ АТФ), Лигированную ДНК-смесь упаковывают в зрелые фаговые лямбда-частицы по- средством известной ин витро лямбда-упаковывающей системы. Компоненты этой системы, т.е. ультразвуковой экстракт (УЭ) лизата, полученный путем замораживания - размораживания (далее: ЛЗР буферы М1 и А), приготавливают известным образом. По 10 мкл лигированной ДНК-смеси в течение 2 мин инкубируют при комнатной температуре вместе с 25 мкл УЭ, который также как и ЛЗР в течение 30 мин размораживают из льда, смешивают со 100 мкл ЛЗР и инкубируют далее в течение 60 мин при комнатной температуре. Упакованную смесь разбавляют 150 мкл лямбда-разбавителя (100 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgSCM, 1 мМ ЭДТА) и хранят при 4°С.

Аликвоту упакованных лямбда-фагов титруют на штамме E.coli NM 528 SupF. В целом получают примерно 1x10 независимых рекомбинантных ДНК собаки. Остаток упакованного материала размножают путем нанесения на газон NM 528 с плотностью 30000 бляшкообразующих единиц (бое) на чашку Петри диаметром 13,5 см с LB-агаром, содержащим сульфат магния.

Скрининг библиотеки для поиска генов интерферона.

Для идентификации рекомбинантных фагов, которые содержат гены собачьего интерферона, используют радиоактивно меченые гены альфа-интерферона человека. Для этого полностью переваривают по 10 мкг высокомолекулярной собачьей ДНК ре- стриктазами EcoRI и Hind III, разделяют электрофорезом на 0,8%-ном агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозные фильтры. Из экспрессионной плазмиды pER33 выделяют Hind Ill-фрагмент длиной 845 пар оснований (по), который содержит протеинкодирующую область для зрелого альфа-2- ARG-интерферона человека.

ДНК метят Р с применением известных методов.

Нитроцеллюлозные фильтры предварительно гибридизуют в течение 7 ч при 65 С в 5 х ССПЕ (0,9 М NaCI 50 мМ NaH2PC4 5 мМ ЭДТА, рН 7,4), 5 х раствор Денхардта (0,1% фикол, синтетический полисахарид с

0 мол, массой 400000), 0,1 % поливинилпирро- лидон, 0,1% альбумин сыворотки рогатого скота, 0,1% ДСН, 20 Mj/мл ДНК из спермы лосося и затем с 13x10 сргп маркированной пробы гибридизуют в таком же растворе, но

5 без ДНК из спермы лосося. После инкубации при 65°С в течение ночи фильтр промывают четырехкратно в течение 1-1,5 ч в ЗхССР (0,45 NaCI, 45 мМ цитрата натрия), 0,1% ДСН при 65°С и экспонируют в тече0 ние 7 дней. Появление нескольких полос доказывает наличие семейства генов альфа- интерферона у собак.

1000000 рекомбинатных лямбда-фагов наносят на E.coli NM 528 плотностью 30000

5 бое/13,5 см пластины. Двукратные нитроцеллюлозные реплики изготовляют с каждой пластины. После обработки в течение 2 ч при 80°С фильтры промывают в течение 1,5 ч при 65°С в 1М NaCI, 10 мМ трис-HCI рН

0 8.0; 0,1% ДСН, предварительно гибридизуют в течение ночи, как описано выше, и в течение 24 ч гибридизуют с 1,5х106 српл радиоактивной пробы альфа-интерферона на фильтр. После трехкратного скрининга пол5 учают 9 клонов собачьего а-интерферона, которые дают положительные сигналы гибридизации.

Характеристика рекомбинантных фагов.

0 Из 9 гибридизующихся с а-интерферо ном человека рекомбинантов готовят фаговую ДНК. ДНК переваривают с помощью EcoRI BamHI, Hind III, Pstl, BgHI, Smal, и разделяют электрофорезом в 0,8%-ном aia5 розном геле.

Величину фрагментов определяют известным образом. Положение рестрикцион- ных мест внутри Лямбда-вставки определяют путем частичного рестрикцион0 ного переваривания лямбда-ДНК, маркировки правых и левых липких концов лямбда-ветвей синтетическими мечеными Р олигонуклеотидами с последующим электрофорезом в 0,45%-ном агарозном ге5 ле.

Субклонирование генов а -интерферона собаки,

Рестрикционный фрагмент клона Са- альфа-11-2, который гибридизуется с «-интерфероновым маркером человека, субкло- нируют в полученное обработкой рестрик- ционными знзиг ами место клонирования вектора pUC9, производного рВ R 322 Вставка постороннего ДНК-фрагмента приводит к прерыванию lac-Z-гена ( //-галакто- зидазы) и таким образом изменяет фенотип трансформированного плазмидой штамма E.coll IM101 от lac + до lac - В результате индуцированный изопролилтиогалактози- дом (ИПТГ) штамм IM101 не может расщеплять до синего красителя бесцветный субстрат-аналог 5-бром-4-хлор-3-индолил- /3 -D-галактозид (X-GAL) Колонии бактерий с фенотипом lac поэтому распознают по белой окраске

Smal-фрагмент длиной 3,7 т п о из клона Са-альфа 11-2 элюируют m гтарозного геля, очищают хроматографией на колонке Элютип-Д и примерно в 10-кратном молярном избытке пигируют с 40 нг разрезанного с помощью Smal и дефосфорилированного вектора pUC9, трансформируют в Е. coli IM101 и заливают вместе с LB-Топ-агаром, содержащим 0,2 мг/мл X-GAL, 0 17 мг/мл ИПТГ и 0,1 мг/мл ампициллина Белые колонии выращивают в 5 мл LB-бульона, содержащего 0,1 мг/мл ампициллина, в течение ночи при 37°С и подвергают скринингу из вестным образом Получинную пои зтгм плазммду называют Таким же -,ом Smal-фрагмент длиной 2,4 г м о m гогг же лямбда слона субклониоуют л Полученную ппазмилу на ью от ri H к

ДПК-последовательность гено собачьего и -интерферона из клона Гз-альф 11- 2

H nd 41-Bn-BKv длиной 3 7 т п г плпэ г-1 1Д-Л рАН2 (ЗгпэЬфрсЭгмен 1 /ушной 1,7 , по субклон Са- « Н-2, поаоергяюг анализу дяя определения последовательности кислйжых остатков 60 мкг ДНК чз плазми- ды рАН2 полностью .ереваоивают с помощью Hind III, фрагмент длиной 1,7 т.п с выделяют из 1 %-ного агарозного геля и очищают, как описано выше 15 мкг этого Фрагмента в 100 мкл буфера для лигировч- ния подвергают лигированию с 14 ед. Т4- ДИ.К-лиг ы при 14°С в те (зние ночи и зятзм подвероют самалиги ов-чию в тече 4 дней Зт/ лигированную ДНК дпобят на мапенькие части в ледяной бане с чо- мощью 20-секундных ультразвуковы импульсов (всего ПО 1-0 о) восстанавливают в те ение 2 ч при 14°С п 250 Mf л реакционной среды (30 трис- HCi, р 7,Г, iO мМ MgCl2, 1 мМ д тиотреи- з 05 мг/мп а. .бумича сыворотки кр.пного рогатою (.tors no 0,1 м л оАТР.

dGTP, dCTP, dTTP с помощью 15 ед большого фрагмента Е соН-полимеразы I (фрагмента Кленова). После концентрирования путем осаждения этанолом предварительно

5 обработанную таким образом ДНК разделяют в 1%-ном агарозном геле и ДНК-фрагменты длиной 0,35 1,0 т.п о. выделяют и очищают Примерно в 10-кратном молярном избытке фрагменты лигируют с разрезан0 ной Smai и дефосфорилированной реплика- тивной формой бактериофага М13 тр8 и трансформируют Е coli IM101 Одноните- вую ДНК рекомбинантных фагов выделяют и после связывания с синтетическим олиго5 нуклеотидом осуществляют двунитевой синтез в 4 отдельные реакции с использованием фрагмента Кленова Е coli ДНК-пол- имерязы

Аналогично анализируют Hind lil-фраг0 мент длиной 1,9 т п о. из плазмиды рАН4 (Sma суЬклон длиной 2,4 кб из Са-альфа-112)

Конструирование экспрессионной плазмиды рРНЮО.

5Все ферментные реакции осуществляют в указанных изготовителями условиях. 7 мкг плазмиды pER103 линеаризируют в 50 реакционной среды с помощью ррс гчикц эннои эндонуклеэзы Hind Ml По0 г ч- 4irvG3 t/M р Трцрч, е 1 ч при I 7 G росае пякк ,j „, , 2хС Р-буфепа о Ъер ,

-,ri О о ,1 7 ГЛ - Г , « ;ог/ .

-1 г пс ной JT -LJ и - ми pi-н т а

РГи ни Т lif,.-1 Ь -KOHLU MMf- -, , мчь к1 . иг,1ч при 4 5JC ч чени1 -/ in ui «

. Я ИНГ ОТ /ioP 4f r Г-и ГМ . i I Ь -,1 Л . On. И 10 ММ -1 I 100-i 1 , О С

Ч 8,С сгчи у/1ату |Г1 rivr-r- i гг -и .- одно1 пат- cv :-.кхгпг,0 i ), сессию Фене/л г, хпоо ДНК осгч ; r ii3 R 71ной )азь лпб р енчем 0, i обь va .М раствора it «зтрцуз рН L Ь, и 2 SO м л ДНК пг-сле иент- риф ,т оования промывают однократно

5 70%-ним оастпором этанола ДНК вмсу ии- вают и 33iCA. осчдок после црнтрь фугироза- нпп раствор,от а РО мкл TF-5yфef (10 мМ грис, рН В О, 1 мМ ЭДТА) По мкг синтети4f C .ДJЗOKCi1 VKЛf5l)TИnOP

С d(AGC A- AIGAGCT) и dfC TCTir) Фос jpi- пру oi u Ю м л pedKurr i burn тмора п, доЬлвп ми 10 РП .4 ПН|ч(пол- янук,Т| -;кинчзы) 1 AIP | еакцию B .iy. i и ,t С ь тсчг- /е 1v ML H°; кц. о

5 осгзг з -л нают О-v .четным нагревани г до 70 ( io 5 мкл раствор и фос фор . ООЬЧНИЫУ олиюнуклеоти/- в ,O / ,,ЛГр&Ь ОТ В Ч;ЧЯ) Ис Ј МИН Д-, 7С° .

е T. J - Зч. гвор ПУП ждч-о; j С°С /у ), , i- jv-кл Ю А н; гс ).

трис, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 200 мМ ДТТ-ди- тиотреитола, 1 мМ АТР. 500 мкг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота), а также 2 мкл воды и 10 ед. Т4-ДНК-лигазы, Реакцию ведут 40 ч при 4°С и прерывают 10-минутным нагреванием при 70°С.

2 мкл продукта реакции в 30 мкл раствора переваривают 10ед. рестрикционной эн- донуклеазы Sac в течение 3 ч при 37°С, Реакцию прерывают путем 10-минутного нагревания до 70°С. 5 мкл этой реакционной смеси в 30 мкл среды лигируют с 10 ед, Т4-ПНК при 14°С в течение 16 ч. 200 мкл штамма E.coll НВ101 смешивают с 10 мкл продукта реакции лигирования. Бактерии выдерживают в течение 45 мин на льду и затем нагревают в течение 2 мин до 42°С, чтобы сделать возможным поглощение ДНК. Затем суспензию бактерий инкубируют снова при 0°С в течение 10 мин. После этого трансформированные бактерии наносят на LB-arap, который содержит 50 мкг/мл ампициллина.

Из образовавшихся колоний бактерий отбирают произвольно 12 и из них выделяют плазмиды. Суммарную ДНК разрезают с помощью рестрикционной эндонуклеазы Sacl и ДНК разделяют в агарозном геле(1%, 1 хТВ Е-буфер). Перемещение ДНК в виде линейной молекулы размером 4400 п.о. подтверждает введение сайта рестрикции Sacl в плазмиду. Одну из этих плазмид произвольно отбирают. ДНК из соответствующего выделения еще раз трансформируют в штамм E.coll HB101. Из полученных трансформированных бактерий выбирают одну колонию и выращивают в большем масштабе. Выделенную плазмиду разрезают ре- стрикционными эндонуклеазами EcoRI и BamHI, ДНК разделяют в 1%-ном агарозном геле и меньший фрагмент выделяют из геля путем электроэлюции. Этот EcoRI- BamHI ДНК-фрагмент длиной 460 п.о. анализируютдляопределенияпоследовательности аминокислотных остатков. Полученную плазмиду называют pRHIOO.

Прямая экспрессия зрелого интерферо- на-21 собаки (СаИФН а 1).

5 мкг плазмиды рРНЮО полностью разрезают с помощью рестрикционной эндонуклеазы BamHI и затем 5 а -концевые фосфаты удаляютс помощью щелочной фос- фатазы кишечника теленка. 30 мкг плазмиды рАН4 переваривают с помощью BamHI. После электрофоретического разделения ДНК в агарозном геле ДНК-фрагменты длиной 0,6 т.п.о, которые содержат всю кодиру- ющую последовательность для Ca-IFN-альфа, выделяют из геля и очищают.

1 мкг этих ДНК-фрагментов длиной 0,6 т.п.о. и 25 нг разрезанной рРНЮО-вектор- ной ДНК в 10 мкл буфера для лигирования (66 мМ трис-HCI, рН 7,2, 0,1 MNaCI, 10 мМ

MgCIa, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола. 0,5 мМ АТР) лигируют с 10 ед. Т4-ДНК-лигазы при 14°С в течение 24 ч.

Клетки E.coll HB101 трансформируют 5 мкл продукта лигирования и наносят на LB0 агар, который содержит 50 мкг/мл ампициллина.

Из образовавшихся колоний изолируют в микромасштабе плазмиду и характеризуют путем рестрикционного анализа с раз5 личными ферментами Плазмиду, которая содержит ген интерферона и триптофано- вый промотор в одной и той же ориентации, называют рАН104. Эта плазмида представляет собой промежуточную стадию получе0 ния окончательной экспрессионной плазмиды для зрелого Са-ИФН-альфа 1.

Конструкция экспрессионной плазмиды рАН4/2. 7 пмоль BamHI-фрагмента длиной 0,6 т.п.о. из плазмиды рАН4 смешивают с 1

5 нмоль синтетического олигонуклеотида (d(TGCCACG TGCCCGAC), который предварительно фосфорилируют с помощью Т4- полинуклеотидкиназы, общий объем доводят водой до 34 мкл. 15-мерный олиго0 нуклеотид содержит кодирующую последовательность для 5М-концевых аминокислот зрелого о. -интерферона собаки. Раствор нагревают в течение 5 мин до 100°С и затем охлаждают, причем находящийся в боль5 шом избытке олигонуклеотид привязывается к комплементарному участку однонитевой ДНК.

Двунитевой синтез, исходя из связанного с олигонуклеотидом затравки, осуществ0 ляют в 70 мкл реакционной среды (50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота, по 1 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP) с 35 ед. фрагмента Кле5 нова ДНК-полимеразы I штамма E.coll в течение 90 мин при 22°С. Реакцию прекращают путем добавки 20 мМ ЭДТА, белки удаляют экстракцией смеси фенола с хлороформом. ДНК осаждают этанолом по0 слэ добавления 0,1 объема ЗМ раствора ацетата натрия, рН 6, и промывают 70%-ным этанолом. Оставшиеся однонитевые ДНК- участки удаляют с помощью Sl-нуклеазы. Для этого высушенный ДНК-осадок раство5 ряют в 300 мкл Si-реакционного буфера (4 мМ ацетата цинка, 30 мМ ацетата натрия, 250 мМ NaCI, 5% глицерина, рН 4,6) и инкубируют в течение 2 ч при 14°С со 150 ед. Sl-нуклеазы. Реакцию прерывают добавлением 20 мМ ЭДТА. Белки удаляют путем

экстракции фенолом и хлороформом После добавки 0,15 объема ЗМ раствора ацетата натрия и 0,6 объема изопропанола ДНК осаждают при 0°С из водной фазы и промывают 70%-ным этанолом Полученную ДНК переваривают с 60 ед, Pstl в течение 2,5 ч при 37°С и затем разделяют электрофорезом в 2%-ном агарозном геле Фрагменты ДНК длиной 300 п о выделяют и очищают

30 мкг ллазмиды рАН104 переваривают с 50 ед Sacl в течение 2 ч при 37°С, фермент инактивируют в течение 10 мин при 70°С После добавления по 0,5 мМ всех четырех дезоксинуклеотидов и 30 ед полимеразы Кленова инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре, чтобы сделать тупыми концы ДНК Белки удалякг путем эк стракции фенолом и хлороформом и ДНК осаждают этанолом Полученную ДНК час тично разрезают 20 ед Pstl в течение 40 мин при 37°С и реакцию поерывают добавлением 20 мМ ЭДТА ДНК разделяют электрофорезом в агарозном геле Фрагменты длиной 4,3 т п.о изолируют и очищают

Полученная ДНК и описанный выше ДНК-фрагмент длиной 0,3 т п о. лигируют в 10 мкл буфера для лигирования с 10 ед Т4-ДНК-В течение 20 ч при 14°С Продуктом лигирования трансформируют клетки Е coli ЕВ 101 и наносят на содержащий ампици лин LB-arap Образовавшиеся колонии бактерий переносят н& свежие агаоовые пластины, а на нитроцеллюлознын фильтры которые наложены ня агаровые пластины. После инкубации при }7°С баг re рии лигируют и ДНК после денатуоирования связывают с HL гроцеллюлозой Остатки клеток удаляют путем инкубации в течение 16 ч при 65°С ь промывном растворе (1 MNaCISO мМтрис-HCI рН 8,0 1 мМ ЭДТА 0,1% ДСП) Фильтры затем гибририз ют в 10 мл раствора (О У MNaCI, 90 мМ трис HCI рН 7,5, 6 мМ ЭДТА 0 1% ДСН 0 1 мкг/мл РНК из Ь coll) с 2х107 српл меченого 32Р олигодезоксинуклеотида d(TGCCACCTGCCCGAC) в гечзние 3 ч при 47°С 18 пмоль олигонуклеогидг и 18 пмоль (у-С2Р) Р(ЗОООС /ммольН 20мкл уфера (70 мМ трис-HCI, рН / 6 10 мМ , 5 мМ дигиотреитопа) инкубирую в присутствии 10 ед Т4-полину 1 -итидкинз : ы - 5 мин при 3 7°С Реакции нчркрачдают доозь ленном 25 мМ ЭДТА и ьееключившуюся р& д оактивносгь отделяют путем хро 1атографии на копонке содержащей . мл биогеля P5-DG

Филыры промывают 4 раза в течение 30 мин при 47°С Промывной раствор соо,- вегсгзует использование у ля гибридизации раствору длб-твкц тРНК Филотр

экспонируют при 80°С Из колоний бакте рий которые дают на ауторадиограмме положительный сигнал гибридизации выделяют плазмидную ДНК После разделе- 5 ния электрофорезом в агарозном геле выделяют рестрикционные фрагменты длиной 0,5 т п о , которые подвергают анализу последовательностей аминокислот

Плазмиду с желаемой структурой назы0 вают рАН4/2 Она позволяет осуществлять экспрессию зрелого СаИФН-альфа в штамме Е coll

Получение плазмиды рАН4/3 Подготовленный для бактериальной

5 экспрессии СаИФН альфа -ген из плэзми- ды рАН4/2 субклонируют в плазмидном векторе par-pATER1Q3

0,5 мкг Hind III - фрагмента длиной 0,5 т п о плйзмиды рАН4/2 и 25 нг разрезэнно0 го с помощью HindlllnBamHIn очищенного на геле плазмидного вектора par-pATER103 в 10 мкл буфера для лигирования инкубируют в присутствии 5 ед Т4 ДНК-лигазы в те чение 3 ч при 22°С Клетки Е coli HB101

5 трансформируют 5 мкл продукта реакции и наносят на LB-arap, содержащий 50 мкг/мл ампициллина Из образовавшихся колоний бактерий произвольно отбирают 6 и из них выделяют плазмиды Плазмиду, которая обJ /laflaei желаемой структурою называю рАН4 j

К1,пг-/е с ir ингерф ОНОЕ - активно сти , uj diw - i uol, г)Б131 ссдеокэщем рАН4/2 и ,и

3ТОО мп 6ah терии 1ьнои Ш кубиPV O1 три чри H tbC БГ/I )

чи /i i- nrciL , in . ж c ri iijv, п плотности при 600 L л сг| -юи еи г со- дер; дол tjj ii гоф ч с L ,ii Р на 1 0 л S i Ч Н4) 0- 3 Ь г К РО/1 гН 7 3 с Naltri ОЕ г , 21 i - а ииоки лот

(( ИСЛ 1 НЬи ГИДрОЛИЗгИ 11 ГЛЮКОЗЫ

vsgS , I мМСаС г тие,„м h/J . мг Ь-цис1€1 на, 20 мг HI доу сзк илсзои кис

Г лоты ,г jp дл1 i от тофансг рона не- обрзаг ч но 50 1C мг змчи п ллик i 6aKicr)ii 1ентриф1 - -1рую гечечиг 5 м тн при ЛОСО оо/ми г а(п°1 УГПРН ИСУЮТ в 1/10 (кулпТ/рал не i оОьема охлс ж/з )ного

f гьдг-v ,j teoa „ я J 3

fS f л/ ОХЛ i- , .1 ПЬДОМ

б чм РН v 30 с л п м j,i jK. ynii разьук 20 У ( 100 l) HI и рч-руш .- НЫА удаляют ь теч, НИР 0 мип при i 10000 эи/к ин (4°С) и чTI.к жид кость после сгери ль ои он испытывают ia интерферон нуи ногт.. по Ci.cTtr в котооои нямсрч L,I ог сзги еCKl Й 3V u ЗИКУЛ, О .,:. с

Тест-система: А-72 (АТСС CRL 1542) опухоль у собаки везикулярный стоматитный вирус.

Активность интерферона в единицах на литр бактериальной культуры составляет 3,2x10 и 3,0х105 для штаммов E.coll, трансформированных плазмидами рАН4/2 и рАН4/3 соответственно.

Формула изобретения

Способ получения собачьего а-интер- ферона, заключающийся в том, что ткань печени собаки инкубируют в присутствии буфера рН 8,0, экстрагируют фенолом, диа- лизуют и осаждают ДНК этанолом, которую в присутствии буфера центрифугируют, ди- ализуют и дсаждают этанолом, полученную при этом ДНК с длиной более 50 т.п.о. подвергают частичному перевариванию эндо- нуклеазой Sau ЗА в присутствии буфера рН 7,5 с последующим фракционированием по размеру путем электрофореза, выделением фрагментов с длиной 10-43 т.п.о., которые после дефосфорилирования клонируют в лямбда-векторе Lambda-EMBL3(-3A) и умножают, полученную ген-библиотеку ДНК под- вергают скринингу с помощью радиоактивно меченых интерфероновых генов человека с выделением гомологичных последовательностей ДНК, Smal-фрагмент с длиной 2,4 т.п.о. отработанного клона Са- а 11-2 лигируют разрезанным с помощью Smal и дефосфорилированным вектором pUC9, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют бактерии E.coll 1M101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАН4, переваривают BamHI, полученный фрагмент длиной 0,6 т.п.о. лигируют с векторной ДНК плазмиды рЯНЮО, предварительно разрезанной ре- стрикционной эндонуклеазой BamHI с по- мощью Т4-ДНК-лигазы удаляют 5 -концевые фосфатные остатки щелочной фосфатаэой кишечника теленка, выделяют плазмиду рАН104, которую переваривают Sacl, концы

полученной ДНК затупляют с помощью пол- имеразы Кленова в присутствии dAfP, dGTP, dCTP и dTTP, полученную ДНК обрабатывают Pstl, и выделяют фрагмент длиной 4,3 т.п.о. и BamHI-фрагмент длиной 0,6 т.п.о. из плазмиды рАН4, лигируют с олиго- нуклеотидом N(TGCCACCTGCCCGAC), предварительно обработанным Т4- пол- инуклеотидной киназой, олигонуклеотид- ную затравку удлиняют с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 штамма E.coll в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP и полученную ДНК осаждают, оставшиеся однонитевые участки ДНК удаляют с помощью 51-нуклеаэы и полученную ДНК осаждают, переваривают Pstl и выделяют фрагмент ДНК длиной 0,3 т.п.о., который лигируют с фрагментом длиной 4,3 т.п.о. с помощью Т4-ДНК-лигазы с получением экспрессионной плазмиды рАН4/2, Hind lll-BamHI-фрагмент длиной 0,5 т.п.о. экспрессионной плазмиды рАН 4/2 лигируют с разрезанным Hind III и BamHI плазмид- ным вектором par-pATER 103 с помощью Т4-ДНК-лигазы с получением экспрессионной плазмиды рАН4/3, полученными экспрессионными плазмидами трансформируют штамм E.coll НВ 101 и трансформанты культивируют, выделяют белок, очищают его путем добавления сульфата аммония до 65%-ного насыщения, центрифугирования, суспендирования полученного центрифугата в буферном растворе, диализа центрифугирования диализата, двухстадийной колоночной хроматографии с использованием на второй стадии связанного с ионитом моноклонального анти-со- бачьего интерферонового иммуноглобулина с последующей эволюцией связанного с антителом интерферона раствором, содержащим лимонную кислоту, доведением элюата до рН 4,5 и хроматографией полученного супернатанта на катионите и элюцией раствором ацетата аммония.