Способ диагностики инсулинзависимого сахарного диабета Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, может быть использовано для иммунодиагностики инсулинзависимого сахарного диабета (I типа).

Целью изобретения является повьш1е- ние точности способа и его упрощение.

Способ осуществляют следующим образом.

Получают поджелудочную железу от крыс линии Бистар весом 200-250 г, готовят криосрезы толщиной 8 микрон и проводят постановку непрямой реакции иммунофлуоресценции, включающей инкубацию с инактивированной при +56°С 30 мин, разведенной в 2-3 раза сывороткой больных, в течение 60 мин при комнатной температуре, отмывку

0,02 М фосфатным буфером рН 7,4, содержащим 0,15 М хлористого натрия (ФБС), и 0,01%-ным азидом натрия 3 раза, инкубацию с ФИТЦ-меченой антисывороткой к иммуноглолубину G человека в течение 60-120 мин при ком-, натной температуре, отмывку ФБС с 0,01%-ным азидом натрия 3 раза, заключение препаратов в глицерол, учет относительной интенсивности реакции иммунофлуоресценции на фотомикроскопе по шкале О, I, IT, III, IV, дифференцированный учет окрашивания островков срезов поджелудочной железы (специфическая реакция).

Пример 1. Больной Н.ЗО лет. В сентябре 1987 года появились жа°лобы на сухость во рту, жажду, похудание на 11 кг, обильной мочевыделение Госпитализирован 1.Х.87 года в клиническую больницу № 6 (филиал) с по- дозрением на сахарный диабет. 7.Х.87 года проведено комплексное иммунологическое обследование: аутоантитела к цитоплазматическим детерминантам островковых клеток (+), поверхностным (+), цитотоксическое действие аутоан тител. У больного диагностирован сахарный диабет (СД) I типа, в связи с чем начата инсулинотерапия. Больной выписан 29,Х,87 года с улучшением,

Постановку теста на наличие ауто- антител к цитоплазматическим дитерми нантам островковых клеток проводят следующим образом. Приготовляют крио срезы поджелудочной железы крысы, пр этом используют орган взрослой крысы (масса тела 250 г),. Железу извлекают немедленно после забоя животного. Тканевые блоки размером мм помещают на картонные кружки с соответст вующей маркировкой, после чего замораживают погружением в жидкий азот. Последующее хранение осуществляют в низкотемпературном холодильнике при -70°С в плотно закрытых чащках Петри Для получения криосрезов блок железы прикрепляют к объектодержателю и переносят Б криостат МК-25, Температуру в камере криостата поддерживают до -18°С, Срезы толщиной 8 мкм мон- тируют на стандартные предметные стекла, предварительно покрытые 0,01%-ным раствором поли-Е-лизина, чтобы обеспечить прочную фиксацию срезов, Высушивают срезы при комнат- ной температуре 30 мин, фиксируют в ацетоне при комнатной температуре в течение 5 с (в стандартном штативе для окрашивания мазков крови), переносят ФБС с 0,01%-ньм азидом натрия,

Сыворотку больного инактивируют в водяной бане при +56°С в течение 30 мин, затем ее разводят ФБС в 2 раза,

Стекла со срезами 1 1, 2, 3, 4, помещают во влажную камеру. На срез № 1 наносят микропипеткой 40 мкл сыворотки больного, инактивированной и разведенной ФБС в 2 раза. На срез № 2 наносят 40 мкл сьшоротки здоро- вого донора, также инактивированной и разведенной ФБС в 2 раза. Па срез № 3 наносят 40 мкл ФБС, На срез № 4 наносят 40 мкл ранее тестированной

сьшоротки больного сахарным диабетом I типа с имеющимися аутоантителами к цитоплазматическим детерминантам ост ровковых клеток. Время инкубации для всех срезов составляет 60 мин во влажной камере при комнатной температуре. Затем срезы помещают в кювету с раствором ФБС с 0,01%-ным азццо натрия и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.

После этого раствор сливают и повторяют процедуру трижды.

По завершении этой процедуры срезы вынимают из кюветы с раствором ФБС, удаляют избыток влаги промоканием фильтровальной бумагой.

На срезы К 1-4, помещенные во влажную камеру, наносят по 40 мкл ФИТЦ-меченой антисыворотки к иммуноглобулину G человека и инкубируют ,,60 мин при комнатной температуре. Повторяют этап отмывки раствором азида натрия трижды и удаляют избыток влаги. Докрашивают срезы К 1-4 0,05% ным раствором толуидинового синего, приготовленного на ацетатном буфере (рН 5,2).для быстрой идентификации островков в проходящем свете. После окраски срезы погружают последовательно в несколько кювет с дистиллированной водой до полной отмывки, те самым удаляют избыток красителя-то- луидинового синего. Удаляют избыток влаги с поверхности препаратов с помощью фипьтровальной бумаги. На покровное стекло наносят разогретый до 40°С раствор глицеролжелатины и таки же покровным стеклом накрывают срезы Затем осущес;твляют просмотр срезов в проходящем свете и идентификацию островков Лангерганса, а также ведут учет флуоресцирующ объектов с использованием фотомикроскопа. На срезе № 1 отмечено у топлазматическое свечение островковых клеток, степень свечения 1-11, В этом препарате отсутствует окрашивание ацинарной ткани. На срезах № 2 и 3 отсутствует реакция с островковыми клетками и ацинарной тканью. На срезе № 4 отмечено цитоплазматическое свечение островковых клеток, ацинарная ткань не окрашена.

Были проверены сыворотки больных в сформированных по клиническим анализам группах СД I типа - смешанная возрастная группа из 23 человек и СД

II типа - 22 человека на срезах поджелудочной железы человека и крысы. Группу здоровых доноров использовали в качестве отрицательного контроля. Было выявлено, что высокая частота выявления специфического свечения при работе со срезами поджелудочной железы человека не отражает истинного процЛта выявления зтого признака. Основанием для такого суждения служит значительный процент выявления неспе- хифических реакций сыворотки больных СД II типа на срезах поджелудочной

методами позволяет избежать гипердиагностики. Метол более прост в исполнении, так как используют п/ж лабора- , торных животных, а не п/ж внезапно умерших людей, т.е. облегчается доступность получения ингредиента для тест-системы. Метод может быть рекомендован в клиинке для диагностики СД.

10

Формула изобре-тения

Способ диагностики инсулинзавижелезы (п/ж) человека (18,2%), а так-15 симого сахарного диабета, включающий же случай обнаружения аутоантител в сьшоротке здорового человека при использовании среза человека. При работе На срезах п/ж крысы полностью отсутствовали неспец1 ические реакции сьшоротки пациентов СД II типа или здоровых доноров с островковыми клет20

забор крови у больного, вццеление сыворотки, нанесение ее на препарат криосреза поджелудочной железы, инкубацию, отмывку срезов с последующей их инкубацией с меченой антисывороткой к человеческому иммуноглобулину и при налич1ш специфического свечения в препарате диагностируют инсулинза- висимый сахарный диабет, о т л и ками, т.е. практически отсутствует гипердиагностика заболевания при использовании предлагаемого способа.

Таким образом предлагаемый способ обеспечивает получение более достоверных результатов в иммунодиагностике СД I типа, полезен для прогнозирования возможного заболевания СД I типа и в дифференциальной диагностике СД. По сравнению с имеющимися

методами позволяет избежать гипердиагностики. Метол более прост в исполнении, так как используют п/ж лабора- торных животных, а не п/ж внезапно умерших людей, т.е. облегчается доступность получения ингредиента для тест-системы. Метод может быть рекомендован в клиинке для диагностики СД.

Формула изобре-тения

Способ диагностики инсулинзависимого сахарного диабета, включающий

забор крови у больного, вццеление сыворотки, нанесение ее на препарат криосреза поджелудочной железы, инкубацию, отмывку срезов с последующей их инкубацией с меченой антисывороткой к человеческому иммуноглобулину и при налич1ш специфического свечения в препарате диагностируют инсулинза- висимый сахарный диабет, о т л и чающийся, тем, что, с целью повышения точности способа и его упрощения, сьшоротку крови больного перед нанесением на препарат криосреза прогревают и после отмьшки препарата инкубируют с меченой антисывороткой в течение 60-120 мин, причем используют криосрезы поджелудочной железы взрослой крысы.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммунодиагностики инсулинзависимого сахарного диабета. Цель изобретения - повышение точности способа и его упрощение. У пациентов берут кровь, выделяют сыворотку, инактивируют ее прогреванием, наносят на среды поджелудочной железы взрослой крысы, срезы инкубируют в течение 60 - 120 мин во влажной камере при комнатной температуре. Затем среды отливают и повторно инкубируют с меченной имунной сывороткой против иммуноглобулина G, учет результатов осуществляют по специфическому цитоплазматическому свечению островковых клеток. По сравнению с прототипом повышается точность диагностики путем снижения уровня гипердиагностики на 18,2% и достигается упрощение способа путем использования для тест-системы срезов поджелудочной железы крыс, что исключает приготовление для этих целей срезов поджелудочной железы внезапно умерших людей.

Составитель В.Литовченко

Редактор И.Горная Техред М.Дидык

Заказ 7507У54Тираж 789Подписное

ВНШиШ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Корректор А.Обручар