Способ определения нейтрофилов, несущих F @ -рецепторы Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

(21)4264813/28-14

(22)19.06.87

(46) (71)

15.12.89. Бюл. № 46

Горьковский научно-исследовательский педиатрический институт и Горьковский медицинский институт им. С.М.Кирова

(72) А.Н.Маянский, И.В.Чеботарь, Е.Г.Зеленова и И.В.Горбунова

(53)612.438 (088.8)

(56)Авторское свидетельство СССР № 1158932, кл. G 01 N 33/54, 1983.

(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙТРО М 10В, НЕСУЩИХ Fg-РЕЦЕПТОРЫ .

(57)Изобретение относится к медицине и может быть использовано для опредепения наличия F -рецепторов на нейтрофилах и оценки состояния противоинфекционного иммунитета. Целью изобретения является повышение достоверности способа за счет стабилизации тест-системы. Для достижения цели проводят обработку растворов IgG-но- сителя,- инкубацию носителя с нейтро- филами с последующим определением клеток, несущих F(,-рецепторы, по их разнице в опытной и контрольной пробах, причем IgG предварительно агрегируют, а в качестве носителя используют CNBr-активированную сефарозу, а инкубацию проводят в течение 20-40 мин. 2 ил.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения наличия FC - рецепторов на нейтрофилах и оценки состояния противоинфекционного иммунитета. Целью изобретения является повышение достоверности способа за счет стабилизации тест-системы. Проводят обработку растворов JGG - носителя, инкубацию носителя с нейтрофилам с последующим определением клеток, несущих F_C - рецепторы, по их разнице в опытной и контрольной пробы, причем JGG предварительно агрегируют, а в качестве носителя используют CNBR - активированную, а инкубацию проводят в течение 20-40 мин. 2 ил.

. Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения наличия F -рецепторов на нейтрофилах и оценки состояния противоинфекционного иммунитета ,

Целью изобретения является повышение достоверности за счет стабилизации тест-системы.

На фиг. 1 и 2 изображены графики, поясняющие предлагаемый способ,

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения Fj -рецепции нейтрофилов человека, включающем инкубацию нейтрофилов с IgG-обработанным носителем используют CNBr-активированную сефарозу 4В, IgG агрегируют, а инкубацию нейтрофилов проводят в течение 20-40 мин при 36-37°С.

Предлагаемый способ отличается от известного 1ем, что в качестве носителя используют CNBr-актиБирован- ную сефарозу 4В, IgG агрегируют, а инкубацию нейтрофилов проводят 20- 40 мин при 36-37°С.

Использование CNBr-активироаанной . сефарозы 4В в качестве носителя IgG позволяет стабилизировать тест-систему, так как активные грудпировки CNBr способны к образованию ковален- тной связи с белками. Использование . других носителей (полистерен, микробные клетки) не обеспечивает образования ковалентной связи с IgG, Использование СЙВг-активированной сефарозы 4В в качестве носителя leG исключает процесс поглощения, так как оазмеры гранул сефарозы (60-120 мкм) делают CNBr-активированную сефарозу 4В недоступной поглощению нейтрофилами. IgG агрегируют, так как посредством агрегации достигается изменение конформационной структуры иммуноглоел ю

;о

to

булина с переходом его FC-фрагмента в положение, наиболее оптимальное для взаимодействия с Fj,-рецепторами клеток, что приводит к повышению стабильности тест-системы,

Инкубацию нейтрофилов проводят 20- 40 мин, так как за это время адгезия нейтрофилов на гранулы IgG-ClBязaннoй сефарозы 4В достигает максимума, за- тем начинает снижаться. На фиг. 1 показан выбор оптимального времени инкубации при взаимодействии нейтрофилов человека и IgG-связанной сефарозы 4В; по оси абцисс - время инкуба- ции, по оси ординат - процент адге- зированных нейтрофилов. Предлагаемые временные параметры являются оптимальными для стабилизации тест-системы м (фиг. 1).,

Выбор температурных параметров (36- 37 с) обусловлен созданием наиболее физиологичных (температура человеческого тела) условий для функционирования нейтрофила и обусловлен экспери- ментально.

На фиг, 2 показан процесс адгезии при различных температурных режимах (выше - -37°С нейтрофил разрушается) и иллюстрирует максимальную адгезию при 36-37°С.

Предлагаемый способ определения Б. О

рецепции нейтрофилов человека имеет следующие преимущества перед известными: в предлагаемой тест-системе носитель ковалентно связан с агрегированным IgG, что делает систему стабильной (срок годности 12 месяцев и более) стабильность обеспечивает хорош ю воспроизводимость определения нейтрофилов несущих F(.-рецепторы, и дает возможность изучать-Е -рецепцию в динамике; данная тест-система позволяет целенаправленно выявить нейтрофилы, несущие FJ.-рецепторы, так как адгезия нейтрофилов в предлагаемом способе инициируется FJ.-рецепторами; предлагаемая тест-система дает возможность получить объективные данные, так как по предоа- гаемому способу исключается процесс поглощения нейтрофилами носителя IgG,

Пример, Иммуноглобулин IgG получают из коммерческого иммуноглобулина методом хроматографии на диэ- гиламиноэтилтояполе-650 М ( Тоуо- Soda, Япония) по методике Брок И. IgG агрегируют прогреванием при 63°С в течение 30 мин. Агрегированный IgG ковалентно связывают с CNBr-ак.-

Q с2Q

- 25

.,,.

); «ь

35

50

, тивированной сефарозой 4В (Pharmacia, Швеция). Для этого лиофилизи- рованную сефарозу 4В, активированную CNBr, регидратируют в 0,001 М растворе НС1 и промывают двумя литрами этого же раствора на пористом стеклянном фильтре. Затем на этом же. фильтре CNBr-активированную сефарозу 4В отмывают 200 м.л связывающего буфера (0,1 М растворг NaCOj , содержащий 0,5 М NaCl, рН 8,3). К промытому осадку сефарозы добавляют раствор ai- регированного IgG (10 мг/мл) из расчета 10 мг на 1 мл геля, инкубируют 2 ч при комнатной температуре или 16ч при 4 С. Переносят гель в буфер с агентом, блокиругадим свободные активные группы CNBr (0,2 М раствор глицина, рН 8,0) и инкубируют 2 ч при комнатной температуре или 16 ч при 4°С. Удаляют недостаточную жидкость и отмывают осадок 200 мл 0,1 М раст- вора СН,COONa, содержащим 0,5 М NaCl, Затем отмывают 200 мл связывающего буфера (0,1 М раствор NaCOj, содер- жатдий 0,5 М NaCl, рН 8,3) и дважды отмывают (по 50 мл) раствором Хенкса. Сефароза 4В, ковалентно связанная с агрегированным IgG, готова к употреблению. Хранят при 4 С, Нейтрофилы выделяют из крови здоровых людей в двойном градиенте плотности фиколл-верог- рафин (1,116 и 1,077 г/см ), взвешивают в растворе Хенкса в концентрации 5 млн, клеток/мл, Смешивают в равных объемах (по 0,2 мл) нейтрофилы (концентрации 5 млн,клеток/нл) и взвесь IgG-связанной сефарозы (концентрация 20000 гранул/мл), инкубируют 20-40 мин при 36-37°С. Контролем служит реакция с сефарозой, не связанной с IgG. После инкубации сефарозы с нейтрофилами в каждую пробирку заливают по 1 мл раствора Хенкса, Через 3 мин, когда гранулы сефарозы осядут на дно пробирки, подсчитывают число клеток в супернатанте с помощью камеры Горяева. Подсчет клеток для О1ЫТНОЙ (с IgG-связанной сефарозой) и контрольной (с сефарозой, не связанной с IgG) проб ведется по всей йа- мере Горяева (в 225 квадратах), Показатель К(ч-рецепции нейтрофилов( ) - процент нейтрофилов, содержащих рецепторы к F,-фрагменту, выражается пр следукнцей формуле,

F ( -25У -- МОО), сконтроль

где опыт - количество нейтрофилов, посчитанных в 225 квадратах камеры Горяе- ва, в опытной пробе; контроль - количество нейтрофилов, подсчитанных в- 225 квадратах камеры Горяева, в контрольной пробе.

В опыте нейтрофилы активнее присоединяются к IgG-связанной сефарозе, поэтому в надосадкё их содержится

меньше по сравнению с контролем. Разделив количество нейтрофилов из над- осадка в опыте на количество нейтрофи лов из надосадка в контроле и умножив на 100, получают процент клеток, оста щихся в надосадке. Следовательно, оставшиеся клетки (от 100% вычесть процент клеток в надосадке) присоединились к IgG-связанной сефарозе - это и есть процент клеток, содержащих ре- цептуры к нов IgG,

F -фрагменту иммуноглобулиПроведена оценка Fg -рецепторов иейФормула изобретения

25

трофилов у исследуемого донора Масте- .ровенко С.А., 22 лет.

В стерильных условиях из вены по-Способ определения нейтрофилов, нелучено 3,0 МП крови. Нейтрофилы вы-сущих F.-рецепторы, включающий обраделяли путем центрифугирования в двух- ботку растворов IgG-носителя, инкуба- ступенчатом градиенте плотности (1 ,1 1 6 цию носителя с нейтрофилами с после- и 1,077 г/см) фиколл-верографин. Пос-ЗО ДУ ОЩИм определением клеток, несущих ле двухкратного отмывания физиологи-F,-рецепторы, по их разнице в опытческим раствором (общий объем 20 мп)ной и контрольной пробах, о т л и нейтрофилы ресуспендировали в растворе Хенкса, Конечная концентрация нейтрофилов - 5 млн. клеток/МП. Все манипуляции прбводили в силиконирован- НОЙ посуде.

CNBr-активированиую сефарозу 4В вязывали с агрегированным IgG по

35

чающий СИ тем, что, с целью повышения достоверности способа за счет стабилизации тест-системы, IgG предварительно агрегируют, в качестве носителя используют Cirfer-активированную сефарозу, а инкубацию проводят в течение 20-40 мин.

102030

фиг. 1

методике фирмы-изготовителя (Pharmacia ,. Швеция) .

Взвесь нейтрофилов с IgG-связанной сефарозой инкубировали в равных объемах (по О,2 мл) 30 мин при (концентрация нейтрофилов 5 млн/мл; кон- цейтрация сефарозы 20000 гранул/мл). В контроле лспользовали сефарозу, не связанную с IgG. После инкубации в каждую пробирку добавляли по 1 мп раствора Хенкса. Затем в камере Горяева подсчитывали количество клеток из надосадка в опыте и в контроле: опыт - 90-|1ейтрофилов; контроль - 150 нейтрофилов.

on

Fj.-ПРН 100-( 00) 100-60 40%.

У исследуемого донора показатель Ед-рецепции нейтрофилов равен 40%, т.е 40% нейтрофилов содержат рецепторы к Fjj-фрагменту IgG.

Формула изобретения

25

чающий СИ тем, что, с целью повышения достоверности способа за счет стабилизации тест-системы, IgG предварительно агрегируют, в качестве носителя используют Cirfer-активированную сефарозу, а инкубацию проводят в течение 20-40 мин.

0

60

.

fffff%.

75- Sff- /5ff C /rr J7-f TfMfrf/fomyfla фиг, 2