Тригидрохлорид 2-[2-фенил-5(6)-бензимидазолил]-N-(3-диметиламинопропил)-5(6)-бензимидазолкарбоксамида в качестве флуоресцентного красителя для исследования ДНК Советский патент 1989 года по МПК C07D235/20 C09K11/06 

Изобретение относится к органической химии, а именно к новому тригидрохлориду 2- 2-фенил-5(6)-бензимида- золил -Ы-(3-диметиламинопропил) -5(6) - бензимидазолкарбоксамиду формулы

V н

N i

((CH 3NHCO у. ,

который может найти применение в качестве красителя в методе ДИК-флуори- метрии.

Цель изобретения - создание нового ДНК-тропного зонда в ряду бис-бензимидазолов, обладающего структурированным спектром флуоресценции, расширяю щего спектральные возможности метода ДНК-флуориметрии.

На фиг.1 приведены спектры флуоресценции препарата (l) и Хехста-33258 в фосфатном буфере (М 0,05) при рН 6,8); на фиг.2 - гистограммы распределения окрашенных клеток тимуса мыши по интенсивности флуоресценции.

Пример 1. Тригидрохлорид 2- 2-фенил-5 (6) -бензимидазолилЗ-N- (3- диметиламинопропил)-5(6)-бензимида- золкарбоксамида.

Раствор 0, г (1,5 ммоль) 3 нитро- 4 - а ми но-N- (З-диметиламинопропил)бенз амида в 30 мл метанола гидрируют при комнатной температуре и нормальном давлении в присутствии Ni Ренея (10 мас.%). После поглощения расчетного количества водорода раствор отфильтровывают в атмосфере аргона, упаривают метанол в вакууме, остаток растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты. К полученному раствору добавляют 0,581 г (1,58 ммоль) гидрохлорида метоксиэтилового иминоэфира 2-фенил-5(6)-бензимидазолкарбоновой кислоты. Реакционную смесь кипятят 5 м. Уксусную кислоту отгоняют в вакууме. Маслянистый остаток затирают до образования кристаллов в 30 мл 7 н раствора хлористого водорода в изо- пропиловом спирте. Осадок отфильтровывают, промывают ацетоном. Выход 0,558 г (68%). Т.пл. 350Ч.

Найдено, %: С 5б,8й; Н 5,21; N 15,25; С1 19,50. (масс- спектрально, в виде основания)

C,,H,,.3HC1

Вычислено, %: С 56,99, Н 5,33, N 15, С1 19,;1. ,5.

Основная область излучения полученного препарата (l) лежит в пределах 350-450 нм, Х 38 нм.

Краситель Хехст J325B обладает следующими спектральными характеристиками; нм в основной област

-/

излучения 410-530 нм (фиг.1).

П р и м е р 2. Интенсивность флуоресценции клеток, окрашенных препаратом (l) или Хехст-33258, пропорциональна содержанию в них ДНК. Гистограммы распределения окрашенных клеток тимуса мыши по интенсивности флуоресценции (фиг.2) идентичны для сравниваемых красителей.

Результаты определения долей клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла (Gg+G,, S и ), полученные при обработке 10 гистограмм для каждого красителя, даны в табг. лице.

Коэффициенты вариации пиков G(,+G( гистограмм невелики, что свидетельствует о высокой стабильности и надежг ности окрашивания. Таким образом, аналогично красителю Хехст-33258

препарат (l) может использоваться для количественной ДНК-цитометрии. Предлагаемый препарат (l) обладает ярко выраженной нуклеотидной специфичностью. Результаты оценки относительной доли АТ-пар в геноме двух животных {ящерицы и мыши), проведенной с помощью сравниваемых красителей, практически одинаковы. Таким образом, препарат (I) обладает нуклеотидной специфичностью АТ-типа.

0

5

0

5

Параметры ДКН- гистограммы:

доля GO-I- , , ,, % доля S, % доля ,% Коэффициент вариации пика

GO+G

Относительная доля АТ-пар в геноме ящерицы по сравнению с геномом мыши

АТя/(АТ+ГЦ я АТмШ+ГЦУм

89,6tO,6

5,3tO,3

5,1±0,3

30,2tO,5

5,0±0,

4,8±0,2

2,5tO,2 2, 4±0,2

0,793±0,015 0,,016

Предлагаемый препарат - тригидро-г хлорид 2- 2-фенил-5(6)-бензимидазо- (З-ДИметиламинопропил)-5(6)- бензимидазолкарбоксамид отличается о от известных ДНК-тропных флуоресцентных зондов тем, что имеет структурированную эмиссионную полосу, не перекрывающуюся с аналогичными полосами известных флуоресцентных меток, и более высокий квантовый выход, что расширяет возможности многопараметрического анализа в клеточной биологии и биотехнологии. Формула изобретения

Тригидрохлорид 2-.2-фенил-5(6)- бензимида золил -N-( 3-диметиламинопро- пил)-5(6)-бензимидазолкарбоксамида формулы

(CHihN CHi NHCO3-знс

в качестве флуоресцентного красителя для исследования ДНК.

Изобретение относится к производным бис-бензимидазолов, в частности к тригидрохлориду 2-[2-фенил-5(6)-бензимидазолил]-N-(3-диметиламинопропил)-5(6)-бензимидазолкарбоксамида, который может быть использован в качестве флуоресцентного красителя для исследования ДНК в биологии. Цель изобретения - создание более эффективных красителей указанного класса. Синтез целевого соединения ведут гидрированием 3-нитро-4-амино-N-(3-диметиламинопропил)бензамида в присутствии NI Ренея при комнатной температуре в среде метанола с последующей обработкой гидрохлоридом метоксиэтилового иминоэфира 2-фенил-5(6)-бензимидазолкарбоновой кислоты при кипячении (5ч). Выход 68%, т.пл. *98350°С, брутто-формула C₂₆H₂₆N₆O^.3HCL, область излучения находится в пределах 350 - 450 нм при λ_MAXъ387 нм. Интенсивность флуоресценции клеток, окрашенных этим красителем, пропорциональна содержанию в них ДНК, причем в отличие от известных ДНК-тропных флуоресцентных зондов, это вещество имеет структурированную эмиссионную полосу, не перекрывающуюся другими флуоресцентными метками, и более высокий квантовый выход. 2 ил., 1 табл.

50100ISO - Собери дн i OfrtH d)ffu клетку

Qj 5

5 5

50 т jso

lQdep)K. ДНК на клетну (отнед) Фиг Z

Xftv sA./