Способ определения лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител в сыворотке крови Советский патент 1989 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине и ка.сается способов идентификации антигенов на поверхности лимфоцитов и антилимфоцитарных антител в среде.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение точности определения,

Способ осуществляется следующим образом.

Из периферической крови или какого-либо лимфоцитарного органа выделяют лимфоциты, на градиенте фиколл- верографина. Клетки дважды отмывают изотоническим раствором (средой 199, средой Хенкса, забуференным физиологическим раствором хлористого натрия) и готовят их взвесь с концентрацией (6-8) 10й клеток в 1 мл (концентрация клеток зависит от чувствительности используемого Т-фосфориметра). К 1 объему взвеси лимфоцитов добавляют равный объем исследуемого субстрата или тест-сыворотки (тест-сыворотка - реагент, содержащий антилимфоцитар- ные антитела определенной специфичности) . Суспензию лимфоцитов перемешивают и инкубируют при 37°С 30 мин. По окончании инкубации клетки однократно отмывают изотоническим раствором и ресуспендируют в объеме 0,4 мл

этого же раствора. В контрольную пробу вносят изотонический раствор.

После удаления кислорода из суспензии лимфоцитов в образце возбуждают триптофановую фосфоресценцию путем облучения в течение 3-5 с ультрафиолетовым светом спектрального диапазона 265-300 нм, после прекращения облучения регистрируют кинетику зату- хания ТФКТ в цифровой или аналоговой формах. Путем обработки результатов регистрации кинетики затухания ТФКТ лимфоцитов опытной (Тл10)и контрольной (м. определяют 0 и Јм ки на ос- новании сравнительного анализа полученных результатов ( к ) определяют наличие лимфоцитарных антигенов или антилимфоцитарных антител.

Пример 1. Из стабилизирован- ной -крови в градиенте плотности фи колл-верографина выделяют лимфоциты и дважды отмывают средой Хенкса. Готовят две порции взвеси лимфоцитов с концентрацией клеток в 1 мл. К тестовой сыворотке анти-Н1А-10 добавляют равный объем взвеси лимфоцитов (опытная проба). Контрольным образцом служат лимфоциты, проинкубированные в изотоническом растворе (растворе Хенк са). После 30 мин инкубации при 37°С контрольный и опытный образцы однократно отмывают раствором Хенкса и осадок ресуспендируют в 0,4 мл раствора Хенкса (рН 7,2). Возбуждают триптофановую фосфоресценцию клеток путем облучения ультрафиолетовым светом и с помощью Г -фосфориметра определяют время жизни триптофановой фосфоресценции контрольной и опытной проб лимфоцитов. н контрольного образца лимфоцитов равно 1,264 с, опытного - 0,&22. Степень снижения времени жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов

35%. i

Следовательно, на исследованных

лимфоцитах экспрессирован антиген Н1А-А10.

Пример 2. Из стабилизированной 2,7% ЭДТА цельной крови в гради- енте феколл-верографина выделяют лимфоциты, которые после их двукратного отмывания средой Хенкса делят на две порции. К тестовой сыворотке анти- Н1А-В41 добавляют равный объем взвеси лимфоцитов с концентрацией 7 в 1 мл и после перемешивания инкубируют 30 мин при 37°С. Контроль - лимфоциты, проинкубированные в растворе Хенк

5

0

5

са. По истечении времени инкубации клетки однократно отмывают и переносят в 0,4 мл среды Хенкса. Определяют (с помощью Ј -фосфориметра) время жиз-1 ни ТФКТ лимфоцитов контрольного и опытного образцов. Время жизни Јд, необработанных анти-Н1А сыворотки лимфоцитов равно 1,161 с, а обработанных 1,138 с, т.е. снизилось на 27,. Такое незначительное изменение времени жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов после их обработки анти-Н1А тест-сывороткой свидетельствует об отсутствии на них антигена Н1А В41.

Пример 3. Из стабилизированной 2,7% раствором ЭДТА цельной крови в градиенте фиколл-верографина выделяют лимфоциты. После их двукратного отмывания средой Хенкса готовят взвесь лимфоцитов в растворе Хенкса с концентрацией клеток 8-Ю6 в 1 мл. К исследуемой тест-сыворотке добавляют равный объем взвеси лимфоцитов и после перемешивания взвесь инкубируют 30 мин при 37°С. Контрольным образцом служат клетки, проинкубированные в растворе Хенкса. После инкубации оба образца однократно отмывают средой Хенкса. 0,4 мл клеточной взвеси используют для измерения параметров ТФКТ лимфоцитов. контрольного образца лимфоцитов равно 1,177, опытного - 0,532. Следовательно, степень снижения обработанных лимфоцитов 54,8%. Такое значительное уменьшение времени жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов свидетельствует о наличии специфического взаимодействия между клетками и антилимфоцитарными антителами, т.е. о присутствии в исследуемом субстрате антилимфоцитарных; антител.

Формула изобретения

Способ определения лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител в сыворотке крови путем приготовления суспензии лимфоцитов и обработки суспензии сывороткой крови, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения точности определения, из суспензии лимфоцитов удаляют кислород, облучают ультрафиолетовым излучением в диа пазоне 265-300 нм, определяют время жизни медленного компонента трипто5 15328736

фановой фосфоресценции при комнатнойгде м к- время жизни медленного ком- температуре (ТФКТ) лимфоцитов и оп-понента ТФКТ лимфоцитов, не ределяют наличие антигенов и антителобработанных сывороткой; .О.Н время жизни медленного ком- Ъ г-понента ТФКТ лимфоцитов, об---- :------ 100% 8%,работанных сывороткой.

/и, к

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител. Цель - упрощение повышения точности способа. Идентификация лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител осуществляется путем определения степени снижения времени жизни медленного компонента (τ_M) триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре (ТФКТ) лимфоцитов после их обработки тест-реагентом или исследуемым субстратом. Способ включает выделение лимфоцитов, их обработку исследуемой или стандартной сывороткой крови или иным субстратом, облучение образцов, из которых предварительно удален кислород ультрафиолетовым светом в диапазоне 250-300 нм и определение τ_M ТФКТ. Снижение ТФКТ на 8% и более обработанных лимфоцитов свидетельствует о наличии тех или иных лимфоцитарных антигенов или антилимфоцитарных антител.