Способ диагностики аутоиммунных заболеваний Советский патент 1991 года по МПК G01N1/28 

(Л

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии. Пелью является повышение точности способа. Цель достигается тем, что лимфоциты крови облучают в течение 2-5 мин светом длиной волны 265-300 нм. Диагностику заболевания проводят по затуханию фосфоресценции мембраны клеток, которое позволяет оценить их дефектность. При снижении фосфоресценции до 30% и более от нормы диагностируют заболевание.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Из периферической крови выделяют лимфоциты на градиенте фиколл-веро- графин.4 Клетки дважды отмывают изотоническим раствором или средой 199 и готовят их взвесь с концентрацией кл./мл. Полученную взвесь лимфоцитов инкубируют 45 мин при 37 С. По окончании времени инкубации клетки ресуспендируют и переносят в кювету в объеме 0,4 мл. После удаления кислорода из суспензии лимфоцитов в образце возбуждают триптофа- новую фосфоресценцию путем облучения в течение 3-5 с ультрафиолетовым светом спектрального диапазона 265300 нм и после прекращения облучения регистрируют кинетику затухания фосфоресценции в цифровой или аналого- 1 вой формах, т.е. определяют время жизни быстрого компонента фосфоресценции и на основании полученных результатов судят о наличии дефектности мембран лимфоцитов.

При этом возбуждается триптофано- вая фосфоресценция при комнатной температуре, обусловленная излучательной дезактивацией«электронно-возбужденных триплетных состояний триптофановых остатков белков. Кинетическая кривая затухания исследуемых образцов в пределах двух порядков интенсивности имеет биэкспоненциальный характер (т.е. представляет собой сумму двух экспонентов) и определяется соотношением

sl

00

|

I

S

e Vе ;

м

где I - интегральная интенсивность свечения в любой момент времени после прекращения возбуждения;

I ., и Ј{ - соответственно начальная

интенсивность и время жизни быстрого компонента свечения ;

I. иси- начальная интенсивность и м м

время жизни медленного компонента свечения, е - основание натурального логарифма; соответствуют промежуткам

времени, в течение которого начальная интегральная интенсивность быстрого и медленного компонентов соответственно уменьшается в е (2,72 раз).

При уменьшении времени жизни быстрого компонента более чем на 55 мс или на 30,5% нормы судят о наличии нарушения структурного состояния мембран-клеток.

Пример 1. Кольная. Калобы при поступлении: постоянные ноющие боли в суставах, боли в области сердца, одышка при физической нагрузке, общая слабость, выпадение волос, головные боли.

Больна в течение 2,5 лет, после переохлаждения появились боли и отечность в коленных суставах, затем присоединились боли в других суставах и мышцах, отмечает повышение температуры до 38°С, потерю в весе. По- ставлен диагноз СКВ.

При объективном осмотре: кожные покровы чистые, бледной окраски. Суставы внешние не изменены, движения в полном объеме болезненные. Дыхание в легких везикулярное. Тоны сердца приглушены, систолический шум над всеми точками, ритм правильный, пульс 78 уд4, в мин, АД 110/70 мм рт.с Живот мягкий, безболезненный, печень и селезенка не увеличены. Видимых отеков нет.

Анализ крови: Нв 108 г/л, лейкоци гы 4,1 хЮ9 /л: С 51%, П 6%, Л 28%, М 9%, Э 5%, СОЗ 35 мм/ч. Общий белок 78 г/л, (X2 -глобулины 9,3%,Ј- 28,6%, СРП , нейреминовая кислота 29,4 ммоль/л, LЈ клетки единичные

5

0

5

0

5 0

0,3 г/л, сахар - нет, L 2-5

пло

в препарате; уровень антител к ДНК (реакция Фарра) - 15 мкг/мл, уровенг комплемента 38,8 . Реакции на РФ - отрицательные. Иммунные комплексы 260 ед.опт.пл. IgG 24,8 г/л, IgM 2,3 г/л, IgA 4,9 г/л, Т-лимфо- циты 39%, В-лимфоциты 12% null лимфоциты 49%; Т-супрессоры 7%; .Т-хел- перы 31%.

Анализ мочи: Уд.вес 1012, белок

1-3

1 скнй эпителий -Диагноз: СКВ, активная фаза, II ст. активности, хроническое течение, люпус-нефрит, полиартрилгия, сиокардиострофия, Н .

Из стабилизированной крови больного СКВ в градиенте плотности фи- коол-верографина въщелены лимфоциты и дважды отмыты средой Хенкга. Приготовлена их взвесь с концентрацией 6-10 клеток/мл. Клетки инкубировали 45 мин при 37°С, затем ресуспендиро- вали, в объеме 0,4 мл переносили в еварцевую кювету и после удаления кислорода измеряли время жизни быстрого компонента ТФКТ лимфоцитов. При этом равнялось 93 мс, т.е. степень снижения от контроля составляла 87 мс или 48%, что свидетельствует о дефектности мембран лимфоцитов обследованной больной.

У данной больной наблюдаются значительные отклонения от нормы подав- , ляющего большинства иммунологических параметров, в том числе показателей клеточного звена иммунной системы свидетельствующих о патологических изменениях иммунокомпетентных клеток.

5

0

5

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность и информативность выявления дефектности мембран лимфоцитов при иммунопатологических заболеваниях. Более высокая точность способа обусловлена возможностью исследования нативного состояния мембран интактных клеток, так как роль мембранного зонда играет природная аминокислота триптофан, входящая в состав мембранных белков. Предлагаемый способ позволяет исключить ряд дополнительных процедур: введение дефицитных, дорогостоящих зондов, дополнительный учет светорассеяния образцов клеток введение поправки на флуоресценцию несвязан516297876

ного с мембраной зонда, сложный ма- дефектными мембранами, о т л и ч а- тематический расчет.ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, облучение Формула изобретения проводят в течение 2-5 мин, при этом

для облучения используют свет длиСпособ диагностики аутоиммунных ной волны 265-300 нм, а дефектность заболеваний, путем исследования мем- мембран определяют по скорости з ату- бран лимфоцитов, облучение их ульт- хания фосфоресценции и при снижении рафиолетовым светом и диагностики дефектности мембран до 30% и более заболевания по наличию клеток с диагностируют заболевание.