Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано при получении моноклональных антител (монАТ) к Са /Mg -зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.
Цель изобретения - получение гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих монАТ к зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.
Штамм получают следующим образом.
Штамм - продукт слияния лимфоцитов селезенки мышей BALB/c и миеломы
X 63.Ag8.653. Мышей иммунизируют экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, содержащим фермент Са - /Mg -зависимую эндонуклеа- зу, при этом для иммунизации используют две схемы.
первая схема. Мышей линии BALB/c, самцов массой 18-20 г иммунизируют подкожно в 5 точек с использованием полного адъюванта Фрейнда в дозе 100 мкг белка на мышь. Через 10 дней антиген вводят внутрибрюшинно в неполном адъюванте Фрейда в дозе 100 мкг белка на мышь, затем иммуни4i
СО
ND
СА
2149
зацию проводят внутривенно в дозе
200 мкг белка, В течение 6 мес животные отдыхают, затем им вводят внутривенно 100 мкг экстракта, через 7 дней иммунизацию повторяют внутриселезе- ночно в дозе 100 мкг белка экстракта и на третьи сутки после разрешающей иммунизации клетки селезенки берут на гибридизацию,
Вторая схема. Мышей той же линии иммунизируют дважды экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека с интервалом 7 дней. Антиген вводят внутриселезеночно в дозе 100 мкг по белку. Гибридизацию проводят на 4 день.
При гибридизации используют клетки миеломы 3 P3,X63,Ag8.653, несекра- тирующие иммуноглобулины, находящиеся в логарифмической фазе роста,
Мьцяей забивают, асептически извлекают селезенку и готовят суспензию Клеток в гомогенизаторе,
Суспензию клеток миеломы и селе- зенки иммунизированных мьш1ей смешивают в плоскодонном флаконе в соотношении 1:10, Затем флакон центрифугируют 200g 5 мин, удаляют суперна- тапт и приливают к осадку по каплям 2 мл 50%-ного раствора полиэтилен- гликоля (М;В, 1500), Клетки суспендируют легким встряхиванием флакона. Через 1 мин во флакон доливают 10 мл среды ДМЕМ, затем в течение 3 мин еще 50-60 мп. Флакон центрифугируют 200g 5 мин, удаляют супернатант и ресуспендирзпот осадок клеток в 60 мл среды DMEM, 15% фетальной сыворотки.
Клетки инкубируют во флаконе при в течение 6-12 ч. После инкубации среду во флаконе заменяют на селективную, имеющую следуюш 1й состав: среда DMEM, 15% фетальной сьшоротки, гипоксантин М, аминоптерин 2 10 М, тимидин 8 10 м, гентами- цин 80 мг/мл (среда DMEM-ГАТ),
Клетки в концентрации 2-310 кл/м 1 аспределяют по лункам плоскодонных 96-луночных планщетов, дно которых предварительно покрыто фидерным слоем сингенных. перитонеальЯых макрофагов ( клеток на лунку), Клетки культивируют в планшетах при 37 С в атмосфере 5% СО2, и при 96% влажности.
Среду меняют каждые 3 сут на 50%, Массовая гибель миел омных клеток наблюдается, начиная с 3 дня культивирования, рост гибридных колоний -наg
5
0
5 о
5
0
чинается на 5-7 день культивирования. Тестирование надосадочных жидкостей проводят, начиная с 10-го дня культивирования после гибридизации, Гибридные клетки культивируют на среде DMEM-ГАТ 30 дней, затем 10 дней на среде DKEM-ГТ (гипоксантин 5-10-3 тимидин 8-10 М) , после чего гибридо- мы культивируют на среде ВЖМ, 15% фетальной сыворотки.
Клонирование гибридом проводят методом лимитирующих разведений,
В результате тестирования надосадочных жидкостей от 200 первичных культур, полученных в результате слияния миеломы с лимфоцитами мышей, иммунизированных по первой схеме, получено 8 стабильных позитивных линий; по второй схеме иммунизации - 13 позитивных линий из 200 первичных культур. Все линии клонированы и заморожены в жидком азоте. Клон DN бып клонирован еще 5 раз, для наработки, антител клон DN культивируют в условиях in vivo в виде асцитной жидкости в брюшной полости сингенных мьш1ей,
Полученный штамм DN депонирован под номером ВСКК(П) № 116D и характеризуется следующими признаками,
Культуральные признаки.
Стандартные условия культивирования - среда Дульбеко с добавлением 10% телячьей эмбриональной сьгаоротки, 4 мм L-глутамина, 80 мкг/мл гентами- цина, 37°С, 5% СО,, 96% влажности, Допустимо использование среды Кгла с добавлением 15% сыворотки крупного рогатого скота.
Для вьфащивания штамма используют стеклянную) или пластиковую посуду. Во флакон объемом 25 см в 5 мл среды вносят клеток DN, Пассаж 1 раз в 3-4 дня той же дозой клеток, Кратность рассева 1:4.
Культивирование в организме животного.
Для выращивания опухоли из штамма пригодны мьшш линии BALB/c. Свежим , мьшам за 7-30 (оптимально 14) дней до инъекции штамма вводят внутрибрю- шинно 0,5 мл пристана. гитамм инъецируют внутрибрюшинно по 3,2x10 клеток на мьш1Ь в 1-мл среды Игла. Асци- тическую жидкость собирают по мере появления (на 10-15 день). Из асцита штамм перевивают на свежих мышей по 1-5x10 клеток на мьш1ь, 4-6 пассажей.
14972136
ном наблюдении и посевах на питательные среды.
Использование штамма иллюстрируется следующим примером.
Пример. Для определения наличия специфических антител в cynef - натантах гибридом используют плоскодонные планшеты, лупки которых пред- ноцитов человека или очищенным препа- ю варительно обрабатывают белком А, ратом Са /Mg -ДНК-азы, добавляют После промывки планшетов 50 т фосПродуктивность штамма.
Секреция монАТ на 4-й день культивирования 10-20 мкг в 1 мл среды и 1-2 мг в 1 мл асцитической жидкости. Метод оценки синтеза антител - гетерогенный иммуноферментный анализ: пластик покрывают белком А, обрабатывают экстрактом клеточных ядер спле
Изобретение относится к гибридомной технологии. Цель изобретения - получение гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к CA2+/MG2+ - зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека. Штамм получен путем слияния лимфоцитов селезенки мышей BALB/C и миеломы X63. AG8.653. Мышей иммунизируют экстрактом клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, содержащим фермент CA2+/MG2+ -зависимую эндонуклеазу. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N116Д. Секреция монАТ на 4-й день культивирования 10-20 мкг в 1 мл среды и 1-2 мг в 1 мл асцитической жидкости. МонАТ JGG2 мыши. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 30 пассажей в культуре и 10 пассажей на животных, если гибридома перевивается. 2 табл.
суперсперальную ДНК плазмиды pBR 322 Положительную реакцию определяют по гидролизу суперспирапьной формы плазмиды после электрофоретического анализа продуктов расщепления ДНК / /Mg -зависимой эндонуклеазой.
Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 30 пассажей в культуре и 10 пассажей на животных, если гибридома перевивается.
Характеристика продукта, Моноклональное антитело IgG i-ibi- ши, Моноклональные антитела способны связывать Са /Мд -зависимую эндо- нуклеазу клеточных ядер спленоцитов человека эндонуклеазы ядер лимфоцитов, периферической крови человека и крупного рогатого скота, гепатоци- тов крыс, селезенки мышей линий СВА, C57BL/6 и BALB/c. Кроме того, монАТ реагируют с эндонуклеазами клеточных ядер тимоцитов линии BALB/c и не реагируют с эндонуклеазами тимуса мышей линий C57BL/6 и СВА, При хроническом лимфолейкозе крупного рогатог скота монАТ связывают эндонуклеазу лимфоцитов селезенки в большей степени, а фермент лимфоцитов периферической крови в меньшей, чем в норме. Эти антитела не реагируют с ДНК-азой I поджелудочной железы быка, щелочной фосфатазой человека, а также с белками крови человека.
Криоконсервирование, Клетки штамма ресуспендируют в эмбриональной телячей сыворотке, содержащей 12,5% диметилсульфоксида, в концентрации 3-4x10 клеток в 1 мл, разливают в пластмассовые ампулы при , Затем клетки замораживают по программе до сниже-ние температуры на 1 С/ /мин, а затем до -196°С по Ю С/мин,
Размораживание: 1 мин при 37 С,Клетки
разводят в 10 мл полной среды и переносят в культуральный флакон.
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длитель
фатным буфером (PBS) и обработки 1%- ным бычьим сывороточным альбумином тестируемые образцы вносят в лунки
5 и инкубируют в течение ночи при
0-4.С, Лунки промывают 4-6 раз PBS, наносят 50 мкл экстракта клеточных ядер спленоцитов человека с концентрацией белкаой,5 мг/мл и инкубируют
0 б ч при 0-4 С. Лунки промывают 2 раза PBS и 2 раза буфером 10 мМ трис, рН 8,0, 10 мМ MgCl, 1 мМ СаС (ИБ), затем вносят субстратную ДПК- суперспиральную форму плазмиды pBR
5 322 в концентрации 0,6 мкг/мл в ИБ и инкубируют в течение 2 ч при 37 С.
Продукты расщепления плазмидной ДНК разделяют в блоках 1,2% агарозы. При нанесении надр езов на субстратной
0 ДНК суперспиральная форма плазмиды переходит в открытую кольцевую и линейную, которые отличаются от ис- суперспиральной формы по элек- трофоретической подвижности. Таким образом, о наличии антител к / /Mg2 -зависимой эндонуклеазе судят по исчезновению суперспиральной ДНК и появлению открытой кольцевой и линейной форм плазмиды pBR 322,
Полученные антитела DN взаимодействуют с очищенным ферментом /Mg2- - -зависимой эндонуклеазой клеточных ядер спленоцитов человека.
Результаты связывания антител DN 5 с очищенной Са /Mg -зависимой эндонуклеазой спленоцитов человека следующие :
Активность зависимой эндонуклеазы, сорбированной на антителах линии DN, %
44,5 .
5
0
Антитела
0
DN Сыворотка крупного рогатого
скота
О
При сорбции на антителах белков- экстрактов клеточных ядер селезенки человека, содержащих Са /Mg -завнсимую эндонуклеазу в комплексе антиген-антитело, обнаруживается фермент проявляю1ций свойства, аналогичные очищенной Са /Mg -зависимой эндо- нуклеазе. В частности, активность фермента в присутствии составляет не более 80% от активности в присутствии Са и не более 32% от активности в присутствии Са и .
Для определения видовой специфичности антител линии изучают их связывание с Са /Mg2 -зависимой эвдо- нуклеазой клеточных ядер селезенки человека, крупного рогатого скота и мышей линии BALB/c,
Связывание антител линии DN с /Mg -зависимой эндонуклеазой. экстрактов клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека 100%, мышей 55% и крупного рогатого скота 37%. Полученные результаты показывают, что антитела DN обладают видоспецифично
стью, хотя могут связывать и фермент эволюционно отдаленных видов живот-).- . ных.
Кроме того, изучено связывание антител DN с различными компонентами клеточного ядра - ДНК, ДНП, РНК и фракцией гистонов. Ни в одном случае связывание антител с названными компонентами не обнаружено.
Использование изобретения позволяет получать монАТ к Ca /Mg -зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П) № 116D - продуцент моноклональньпс антител к Са /Mg -зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.
