Способ выделения соматотропного белка из светопреломляющих тел клеток хозяина Советский патент 1990 года по МПК A61K38/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выделения соматотропного белка из клеток E.Coli.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение качества целевого продукта.

На фиг.1 и 2 приведены графики зависимости общего количества солюбили- зированного белка от концентрации мочевины; на фиг.З - график выхода мономера в зависимости от концентра-/-х. ции мочевины.

П.р и м е р 1. Солюбилизация бычьего N-метионилсоматотропина (MBS), экс- прессированного в E.Coli.

Собранные клетки разрывают, пропуская их два раза через гомогенизатор

типа Man ton-Gaul in homo genizer. Pa- створ гомогената подвергают низкоскоростному центрифугированию, в результате чего светопреломляющие тела, содержащие MBS, осаждаются. Надосадоч- ную жидкость выбрасывают, повторно взвешивают светопреломляющие тела, промывают и снова центрифугируют их. Опять выбрасывают надосадочную жидкость и получают преперат светопреломляющих тел.

Препаратированные описанным образом светопреломляющие тела при 25°С подвергают воздействию разных концентраций водного раствора мочевины при разных значениях рН. Все забуферованные растворы содержат 100 ммоль трис осно

см

вания. Регулирование значения рН осуществляют добавлением НС1. Конечная концентрация светопреломляющих тел составляет 4 мг/мл раствора. Степень растворения определяют спектро- фотометрически, принимая светопреломляющие тела полностью белковыми и используя коэффициент экстинкции Е 0,68 при 277 нм в длине пути 1 см в качестве показателя концентрации белка 1 мг/мл. Исход- ; ную концентрацию определяют спект- рофотометрически для полностью растворенной пробы.

Результаты описанного опыта представлены графически (фиг.1). Эти данные подтверждают, что регулировка значения рН с обеспечением щелочных условий существенно увеличивает сте- пень солюбилизации.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но температуру выдерживают на уровне 4 С и значение рН ре- гулируют и в сторону кислой и в сторону щелочной реакции. Все забуферо- ванные растворы содержат 100 ммоль- трис-основания. Регулирование значения рН в сторону кислой реакции осу- ществляют добавлением уксусной кислоты.

Результаты этого опыта представлены графически (фиг.2). Сравнение данных фиг.1 и 2 показывает, что при пос тоянной концентрации раствора мочевины, и данном значении рН степень солюбилизации при пониженных температурах (4°С) выше, чем при комнатной температуре (25°С).

ПримерА(сравнительный). Содержащие MBS светопреломляющие тела приготавливают согласно примеру 1. Светопреломляющие тела смешивают с 10 М раствором мочевины без регулиро- вания значения рН, так что окончательная концентрация тел составляет около 5,0 мг/мл. Затем смешивают раствор и в целях установления равновесия выдерживают его при 4°С в течение но- чи. Затем спектрофотометрическим способом определяют степень солюбилизации, которая составляет всего лишь около 2,9 мг/мл. Исходную концентрацию светопреломления тел определяют путем добавления достаточного количества раствора мочевины в целях полного их растворения и спектрофотометри- ческого измерения полностью раство

5

0

5 0

5

0

5 -Q

5

ренного раствора. Затем исходную концентрацию соответственно понижают.

П р и м е р Б (сравнительный). Содержащие MBS светопреломляющие тела приготавливают согласно примеру 1. Затем смешивают с 8,0 М водным раствором мочевины без регулирования значения рН, так что окончательная концентрация тел составляет около 5,0 мг/мл. Раствор затем смешивают и в целях установления равновесия его выдерживают при 4°С в течение ночи. Спектрофотометрическим способом определяют степень солюбилизации, которая составляет около 2,4 мг/мл. Исходную концентрацию светопреломляющих тел определяют путем добавления достаточного количества раствора мочевины в целях полного их растворения и спектрофотометрического измерения полностью растворенного раствора. Затем исходную концентрацию соответственно понижают.

Пример 3. Светопреломляющие тела, содержащие MBS и приготовленные, аналогично примеру 1, смешивают с небуферованным водным 4,5 М раствором мочевины так, что концентрация светопреломляющих тел составляет около 66 мг/мл. Значение рН раствора с помощью разбавленного раствора едкого натра повышают от 7 до 11. Осветлившийся раствор показывает полную солюбилизацию. Определенная по примеру 1 спектрофотометрическим анализом концентрация светопреломляющих тел составляет 66 мг/мл.

Пример 4. Содержащие MBS светопреломляющие тела, полученные по примеру 1, солюбилизируют в водном 7,5 М растворе мочевины, содержащем 100 ммоль триса при значении рН 10,5. Концентрацию мочевины поддерживают на разных уровнях, добавляют 100 ммоль триса, и выдерживают общую концентрацию белка около 1 мг/мл, определенную спектрофотометрическим анализом полностью растворенной пробы, добавляя определенное количество соответствующего раствора мочевины. Затем растворенный MBS окисляют, подвергая раствор воздействию воздуха и перемешивая его в течение суток. Результаты представлены графически (фиг.З). Выход мономера MBS указан в виде весовых процентов общего содержания MBS. Оптимальная натурация достигается

jirpH концентрации мочевины около 4,5М (фиг.З).

Пример 5. Согласно примеру 4 содержащие MBS светопреломляющие тела солюбилизируют в водном 7,5 М ра -- створе мочевины с содержанием 100 ммоль триса и со значением рН 10,5. После солюбилизации раствор разокисляют кислородом воздуха в течение ночи с перемешиванием. Данные БЖХ-ана- лиза показывают, что оптимальный выход мономера MPS достигается при концентрации мочевины 3 М.

Пример 8. Аналогично примеру 7 солюбилизируют MPS при 4°С в водном 7,5 М растворе мочевины со значе

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выделения соматотропного белка из светопреломляющих тел клеток хозяина. Цель - упрощение способа и повышение качества целевого продукта за счет сохранения его нативных свойств. Для этого солюбилизацию белка проводят 4,5-10 М раствором мочевины или диметилсульфона при PH 9-12,1 и температуре 4-25°С, а натурацию осуществляют в водном растворе 2-5 М мочевины при указанных значениях PH и температуры, причем вторую операцию проводят в присутствии мягкого окислителя. 2 табл.

бавляют 100 ммоль триса до концентра- JQ нием рН 11, отрегулированном добавкой ции мочевины 4,5 М, после чего значе- 90 ммоль триса. При этом приготавли- ние рН доводят до значений в пределах вают растворы трех разных концентраций от 10,5 до 8,5. Затем отдельные раст- (20,40 и 80 мг (мокрого) шарика на воры окисляют кислородом воздуха с 1 мл указанного раствора мочевины), перемешиванием в течение суток. Содер-15 Пробы растворов разбавляют 90 ммоль жание мономера и олигомера определяют триса и/или мочевиной в целях получе- по данным БЖХ. Хотя результаты указы--; ния 3 М концентрации мочевины и кон- вают на то, что зависимость эффектив- центраций MPS 1 мг/мл. Разбавленные

растворы MPS с перемешиванием подвергают воздействию воздуха при 4°С в . течение 56 ч. БЖХ-анализ показывает

ности натурации от значения рН в течение процесса окисления относительно ровная, но тенденция к увеличению эффективности по мере повышения значения рН наблюдается. Кроме того, процесс катализируемого основанием окис20

средний выход мономера MPS, равный 69 мас.%.

Пример 9. Проводят аналогичления протекает тем быстрее, чем но примеру 8, но солюбилизацию и на-,

лее выражена щелочная реакция раствора.

Пример 6. К 850 мл водного 5,3 М раствора мочевины при 4°С добавляют 150 мл полученного по примеру 1 препарата светопреломляющих тел. Значение рН полученного 4,5 М раствора мочевины 50 мас.%-ного раствора едкого натра доводят до 11. Тела полностью растворяются, в результате чего получается общая концентрация MBS около 12,4 мг/мл. Затем раствор перемешивают при 4 С в течение ночи в целях окисления MBS. В соответствии с данными БЖХ-анализа окисленного раствора в результате получают выход мономера MBS, равный 80 мас.%.

Пример 7. Свиной S-метионил- соматотропин (MPS) экспрессируют в E.Coli. После выделения содержащих MPS светопреломляющих тел по описанному методу последние солюбилизируют при 4°С в 7,5 М растворе мочевины со значением рН 11,0, отрегулированном добавкой 90 ммоль триса. Затем на 1 м полученного раствора мочевины растворяют шарик светопреломляющего те- ,ла весом 1 13 мг (в мокром состоянии). Затем пробы разбавляют 90 ммоль триса и/или мочевиной в целях получения ра- створа мочевины концентрацией 4,5; 3,0 и 2,0 М с концентрацией MPS 4 мг/мл, считая на вес мокрого шарика светопреломляющих тел. Потом пробы

средний выход мономера MPS, равный 69 мас.%.

Пример 9. Проводят аналогич0

5

0

е

турацию осуществляют в присутствии 0,1 ммоль 1,4-дитиотрейтола. БЖХ-ана- лиз показывает средний выход мономера MPS, равный 66 мас.%.

Пример 10. Три варианта BGH: A-la(, Ala, и Met, Val ,26 , экспрессируют в E.Coli по известным приемам. Отдельные варианты BGH солюбилизируют и подвергают натурации аналогично примеру 1.

Содержащие соответствующие варианты BGH светопреломляющие тела выделяют аналогично примеру 1. Затем взвешивают в воде около 300 г (в мокром состоянии) тел с получением 1 л взвеси. Последнюю добавляют к 5 л 9 М мочевины и 108 ммоль триса, в результате чего получают солюбилизирую- щий раствор, включающий соответству5 ющий вариант BGH в 7,5 М мочевины и 90 ммоль триса при значении рН 10,5 и 4°С. После перемешивания в течение нескольких минут солюбилизацию завершают. Затем медленно добавляют 4 л

0 холодной воды с получением предназна- -ченного для натурации раствора, содержащего соответствующий вариант BGH в 4,5 М мочевины и 54 ммоль -триса при значении рН 10,5 и при 4°С. Раствор перемешивают и соответствующий BGH окисляют, подвергают раствор воздействию воздуха в течение 48 ч. Растворы с окисленными вариантами BGH подвергают БЖХ-анализу, который для

всех трех вариантов BGH показывает выход мономера 60-70 мас.%.

Пример 11. Структурную гомологию соматотропинового белка, полу- ченного описанным образом, и сомато- тропина, вырабатываемого гипофизом, определяют методом Circular dichro- mistn. Сравнивают MBS и вариант Ala., соматотропина BGH с бычьим соматотро- пином. Пробы растворяют в растворе 50 ммоль бикарбоната натрия при значении рН 9,5 и анализируют их описанным приемом.

Данные этого анализа показывают, что полученный описанным образом ре- комбинантный соматотропин после на- турации имеет свою нативную конформа- цию.

Спектральные данные приведены в табл. 1 и 2.

Пример 12. Содержащие MBS светопреломляющие тела приготавливают аналогично примеру 1 и смешивают с небуферованным 1,0 М водным раствором мочевины при 4°С. Добавкой гидроокиси натрия доводят значение рН до 12,1 и выдерживают его на этом уровне. Осветление раствора говорит о за- вершении солюбилизации. Концентрацию светопреломляющих тел определяют аналогично примеру 1 методом спектрофо- тометрического анализа, которая coc-v тавляет около 10 мг/мл.

Пример 13. Содержащие MBS светопреломляющие тела приготавливают аналогично примеру 1. Затем их растворяют в 3,0 М раствора диметилсуль- фона при 28°С (рН 11,8) при концент- рации MBS 2 мг/мл. В результате окисления кислородом воздуха растворенного MBS получают продукт, который (судя по степени межмолекулярной связи), только незначительно отличаются от продукта, полученного с применением 4,5 М раствора мочевины со значением рН 11,3 (50 ммоль триса) при 5°С.

Солюбилизованные и натурированные описанным образом соматотропины затем очищаются по стандартным хроматогра- фическим приемам. Биоактивность сома- тотропинов показана положительной реакцией, вызванной ими в испытаниях, основанных на росте крыс (rat growth, bioassy).

При этом биоактивность гетеролого- вого саматотропина определяют относи

5

0

5 о

Q 5

0

5

5

тельно известного количества сомато- тропинрвого материала (например, бычьего или свиного гипофизарного соматотропина), устанавливая взаимосвязь между увеличением в весе крыс, подвергнутых гипофизэктомии, и разными количествами введенного в их организм испытуемого материала. Наклон регрессии увеличения в весе тела в сравнении с дозами введенного специфического соматотропинового материала сравнивают с известным стандартным материалом (например, гипофизарным) и подсчитывают относительную биоактивность гетерологового соматотропинового материала в U ед./мг гормона роста.

Бычий N-метионилсоматотропин, со- любилизированный и натурированный по предлагаемому методу, очищают, а затем вводят в организм молочных коров. Молочные коровы, которым введен подобный препарат, продуцируют на 10- 40 мас.% больше молока, чем контрольные животные.

Выражение соматотропин включает соматотропины млекопитающих, например человеческий, овечий, свиной и бычий соматотропины, и другие соматотропины, например птичий, а также системы, включающие аналоги и гомологи встречающегося в природе белка, проявляющего соматотропиноподобную биоактивность, например пролактин и лактоген (HPL).

Гетерологовые белки - это белки, которые обычно не вырабатываются клетками хозяина. Благодаря технологии рекомбинации ДНК стало возможно экспрессировать относительно большие количества гетерологовых белков из трансформированных клеток хозяина. Однако, эти посторонние белки часто , замаскированы в нерастворимых светопреломляющих телах в цитоплазме клеток хозяина.

Сложение - восстановление общей конформации белка, достаточной для осуществления окисления надлежащим образом. Процесс сложения осуществляется путем сокращения денатурирующего действия мочевины, если необходимо, за счет понижения ее концентрации до нужного уровня для обеспечения взаимодействия последовательности аминокислот белка и достижения на- тивной вторичной и третичной структур.

Окисление - образование внутримолекулярных дисульфидных связей в целях получения устойчивой нативной конформации, обеспечивающей требуемую биологическую активность.

Мягкий окислитель - вещество, содействующее окислению сульфгидриль- ных групп для образования внутримолекулярных дисульфидных связей без окис- ю чий соматотропин, HGH - соматотропин

ления других заместителей данного белка. Хотя можно пользоваться и такими мягкими агентами, как перекись водорода, но вполне достаточно (и предт почтительно) использовать для этих целей воздух.

Биологическая активность - способность соматотропина к осуществлению его предполагаемой физиологической реакции in vivo. В случае отсутствия испытания на специфическом виде животного in vivo биологическую активность можно олределять путем проведения подходящих биологических испытаний. Подходящим биоиспытанием для со- матотропинов по предлагаемому способу является биоиспытание для определения увеличения в весе у крыс. При этом испытании определяют биоактивность соматотропиновых препаратов по сравнению с известными препаратами (например, экстрагированным нативным соматотропином), устанавливая связь между степенью увеличения в весе у крыс, подвергнутых гипофизэктомии, и разными количествами введенного в организм крыс препарата.

Соматотр опины - это гормоны, выделяемые аденогипофизом (передней долей гипофиза) и стимулирующие рост скеле- та и увеличение веса тела. Соматотро- пины обычно содержат 191 аминокислотных остатков и имеют мол.массу 2200.0 дальтон. Полная последователь

ность аминокислотных остатков установ- д солюбилизацию проводят в присутствии

лена для соматотропинов разных видов, в том числе людей и животных, например птиц (птичий соматотропин), овец

(овечий соматотропин), свиней (свиной соматотропин), крупного рогатого скота (бычий соматотропин).

В табл.3 изображена первичная структура соматотропинов разных виден. животных, причем BGH - бычий соматотропин, PGH - свиной соматотропин, OGH - овечий соматотропин, AGH - пти5

0

5

д

0

5

человека, символ X обозначает промежуток в последовательности и вставлен для иллюстрации расположения типовых соматотропинов. При нумерации аминокислотных остатков специфической последовательности эта вставка не принимается во внимание, например в BGH позиция 1 26- представляет собой Leu (или Val, как в случае аллельного варианта, использованного в примере 10).

Табулированные относительные количества специфических аминокислот, основанные на описанных последовательностях, приведены в табл.4.

Формула изобретения

Способ выделения соматотропного белка из светопреломляющих тел клеток хозяина, включающий проведение солю- билизации с последующей натурацией и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения качества целевого продукта за счет сохранения его нативных свойств, в качестве клеток хозяина используют бактерии E.Coli, солюбилизацию проводят 4,5- 10 М раствором мочевины или диметил- сульфона при рН 9-12,1 и температуре -25°С, а натурацию осуществляют в водном растворе 2-5 М мочевины при рН 9 - -12,1 и температуре 4-25°С, причем

или отсутствии восстанавливающего агента,-а натурацию - в присутствии, мягкого окислителя.

I

макс НМ

А, см

278,2

15,042 ±440

0,690

278,2

14,935± 216 0,680

Примечание. Ем - коэффициент экстинкции при 278 нм.

А10°- нормализованная абсорбция I мг/мл раствора в ячейке размером I,0 см при 278 нм.

291 285 265 221 об-спираль

278,5

15,150± 100 0,693

Таблица 2

13 154240214

Таблица 3

120

ВОНPhe-Pro-Ala-Mel-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Va I-Leu-Arg-Al a-Gin-Hie-LeuPGH-ProSer----

OCH

ACH-ProAsn

HCHThr-lle-ProArgAspMetHis-Arg

3040

BGHHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-Glu-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Clu-Gly-GlnPGH-TyrAla-

OGH

AGHLeuGinTyr-Aip--HGHPheTyr-GlnGlu-AlaLys-Glu

5060

BGHArg-Tyr-Ser--X--Ile-Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Cys-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-AlaPGHAlaAla

OGH-

AGHThrAsn-LysSerAlaTyr-

HGHLys---Phe-Leu--ProThr-Ser-Leu-Ser--Thr7080

BGHPro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-Cln-Lys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-LeuPGHAsp-ArgValPhe

OGH«

AGHAsp-AspMet-GlyPhe

HGHSer-Asn-Arg-GluThrAsnGin

90,100BGHLeu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Atn-Ser-

PGHVal

OGHr-

AGHVal™--ThrValTyrLysAsnHGH--GluVal---Arg-Ser--:Ala

110120

BGHLeu-Val-Phe-Gly-Thr-Ser-Asp-Arg-X--Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-GlyPGH-

OGH---

AGH-Phe

HGHTyrAlaAsn-Ser-AspAsp-Leu

r 130140

BGHlle-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-LysPGHGin-Ser

OCHVal-

ACHGin-Arg-SerGly-ProLeuArgHGHGln-ThrGly-ArgSerThr-Phe

150160

BGHGln-Thr-Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp-Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-TyrPGHLeu

OGHT-

AGHPro-Ile-His-LeuAsn-Glu---

HGHSer-Sec-His-Asn

170180

BGHCly-Leu-Leu-Ser-Cys-Phe-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-Val-MetPGHLysAla

OGH--ACT LysValLys--

HGHTyr-ttet-AspValPhe-Ile-Val190

BGHLys-Cys-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala -Ser-Cys-Ala-PhePGHValSer

OGH

AGH---.Ser-AsnThr-IleHGHGinXSer-ValtGly-Gly

ц кнпвэьои впъ-одшнаЬноч

L9S

-I1|

l Щ

W 9W/1p9hOW П.ЬоС/ ан9ПНО

1111H

nxgodru/fiisd суд dogungj

to/ 5

MZ

и

{

Qh f

с

ю|

i г

af I

at

OB

№

m

0г

са

+ 0

i« S

4 л

Л

ooi$ V

20WWI

70-#

I

Ј

&

§ да I

c

t567

Концентрация мочебинь H

Фие.З