Стимулятор эмбриогенеза в культуре растительной ткани Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению эмбриоидов и регенерантов в культуре растительной ткани.

Объектами исследования служили культуры тканей табака (Nicotiana tabacunO и мака прицветникового (Pa- paver bractearum Lindl).

Культура тканей табака широко используется как модельный объект в различных направлениях селекционно- генетической работы in vitro, а также как продуцент ряда ценных веществ, в частности убихинона. Культура тканей мака прицветникового представляет собой перспективный источник мор- финовых алкалоидов. В последнее время все большее внимание уделяется разработке способов выращивания культур

тканей - продуцентов ценных вторичных метаболитов, сохраняющих способность к морфогенезу. Так, в существующих ныне штаммах мака прицветникового спектр синтезируемых алкалоидов изменен в сторону бензофенантридиновых алкалоидов, а морфиновые, в частности тебаин, появляются лишь в эмбриоидах и регенерантах. Поэтому надежный и эффективный способ получения регенерантов важен для обоих видов.

Цель изобретения - ускорение эмбриогенеза и увеличение количества эмбриогенных зон в культивируемой ткани.

Способ состоит в том, что на культивируемые ткани растений воздействуют парафторфенилаланином, добавляя его в питательную среду в концентсл

4 4ъ

СО

00

315

рации 10-100 мг/л. Это соединение является известным. Парафторфенилаланнн используется как селективный фактор для поддержания пролиферации гаплоидных клеток в культурах тканей растений. Как стимулятор эмбриогенеза ранее он не применялся. Ткани предварительно выращивают в течение нескольких ростовых циклов на обычной пита- тельной среде с добавлением парафтор- фенилаланина до их перевода на эмб- риогенную среду, либо сразу переводят на эмбриогенную среду, содержащую парафторфенилаланин. В течение 1-3 ростовых циклов отбирают эмбриднды и регенеранты, укореняют их и высаживают в грунт или культивируют далее in vitro.

Пример 1. Культуру тканей табака получают и выращивают на модифицированной питательной среде Мура- сиге-Скуга, которой присвоен индекс МС-2. Среду готовят так, чтобы в 1 л ее содержалось, мг:

Среду разливают в сахарные пробирки по 6 мл в каждую, автоклавируют 15 мин при 1 атм. После застывания среды ткань табака рассаживают по 0,3-0,4 г на пробирку. Через 30 сут ткань пересаживают на свежую среду. После культивирования в течение 7 мес. ткань обоих вариантов переводят на эмбриогенную среду Т-3 и выставляют на свет (12-часовой световой день, лампы дневного освещения, освещенность 1800-2000 лк, температура 26 ±1°С).

Среду Т-3 готовят так, чтобы в 1 л ее содержалось, мг:

c

п 5

0

5

0

KNO,

CaClt MgSO«- КНгР04

нэвоэ

MnS04 4H20 СоС12-6Н40 CuS04 SH-,0 ZnSO.

2H,0

7HaO

t -. 2Н„0 KJ

FeS04-7H20 Na2EDTA Тиамин Мезоинозит Са-Пантотенат Гидролизат казеина Индолилуксусная кислота Кинетин Сахароза Агар-агар Дистиллированная вода

550 633,3 146,6 123,3 56,6 6,2 22,3 0,025 0,025 8,6 0,25 0,83 27,8 . 37,3 0,4 80 5 1000

0,2

1,5

50000

8000

До 1 л

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методам культивирования растительной ткани и может быть использовано для нужд клеточной и генетической инженерии. Целью изобретения является ускорение эмбриогенеза и увеличение количества эмбриогенных морфогенетических зон в культивируемой ткани. Способ состоит в том, что на культивируемые ткани растений воздействуют парафторфениланином, добавляя его в питательную среду в концентрации 10-100 мг/л, применяя тем самым данное соединение в качестве стимулятора эмбриогенеза. Способ позволяет увеличить выход эмбриогенных морфогенетических зон на культивируемой ткани, а также получать большое количество эмбриондов и регенерантов уже в первом пассаже. 2 табл.

Гидролизат казеина оШафтилуксус- ная кислота Индолилук сусна кислота Кинетин Сахароза Агар-агар Дистиллированная вода

В среду добавляют Дополнительно 60-100 мл/л парафторфенилаланина. В качестве контроля выращивают ткань на питательной среде приведенного состава без добавления парафторфенил- рланина.

5

0

5

Результаты анализа трех последовательных ростовых циклов на эмбрио- генной среде представлены в табл. 1. После выращивания тканей на среде, содержащей 100 мг/л парафторфенилаланина, предлагаемый способ превосходит известный по частоте регенерации (отношение субкультур с эмбриоидами к общему числу субкультур) в 1-м, 2-м и 3-м пассажах соответственно в 3,5; 3,3 и 2,7 раза. В среднем за три пассажа предлагаемый способ повышает частоту регенерации более чем в 3 раза по сравнению с контролем. Количество эмбриоидов и регенерантов на отдельную субкультуру опытного варианта намного превышало контрольное.

При более низких концентрациях (80 и 60 мг/л) парафторфенилаланин подобного эффекта не обнаружил.

Пример 2. Для выращивания культуры тканей мака прицветникового готовят модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга (индекс среды - PW так, чтобы в 1 л ее содержалось, мг/л:

NH4NO,1650

KN031900

СаС17440

MgS04-7H,0370

КНаР04170

Н3В056,2

Мп504-4Н2022,3

СоС17 6Н200,025

CuS04 ,025

ZnSO« ,6

Na-гМоО, 2Н700,25

KJ0,83

FeS04-7H2027,8

Na-jEDTA - ,3

ТиаминО, 1

Мезоинозит100

Пиридоксин0,5

Никотиновая кислота0,5

Гидролизат казеина500

Глицин2 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота1

Кинетин1

Сахароза30000

Анар-агар8000 Дистиллированная

водаДо 1 л

Среду разливают в пробирки по 5 мл каждую. Стерилизуют 15 мин при атм. После застывания среды ткань ака рассаживают по 0,3-0,5 г на проирку и культивируют, пересаживая кажые 15 сут на свежую среду.

Затем готовят эмбриогенную питаельную среду как описано, исключая з ее состава 2,4-дихлорфеноксиуксус- ую кислоту и кинетин и добавляя пара0

0

фторфенилаланин в концентрации 10 - 60 мг/л. Ткань мака со средним темпом роста в возрасте 15 сут переносят на эмбриогенную среду и выставляют на свет (12-часовой световой день, лампы дневного освешения, освещенность 1800-2000 лк, температура 26±1°С). В качестве контроля выращивают ткань на указанной эмбриогенной среде без добавления парафторфенилаланина. Результаты анализа двух последующих ростовых циклов представлены в табл.2. Как видно из приведенных данных,

5 частота регенерации в опыте (при концентрации парафторфенилаланина 10 мг/л) в 1-м и 2-м пассажах была соответственно в 4,6 и 1,5 раза выше, чем в контроле. Предлагаемым способом удалось получить в 1-м пассаже в 4,9 раза больше, а во 2-м - в 2,4 раза больше эмбриоидов в расчете на каждую субкультуру по сравнению с контролем. В среднем за два пассажа культивирования предлагаемый способ позволяет увеличить выход эмбриоидов на каждую субкультуру более чем в 3 раза по сравнению с контролем. При концентрации парафторфенилаланина 30 мг/л незначительный эффект стимуляции регенерации отмечен в первом пассаже. При более высокой концентрации (60 мг/л) парафторфенилаланин подобного эффек- 1 та не обнаружил.

Таким образом, предлагаемый способ

5 позволяет интенсифицировать процессы регенерации в культуре тканей табака и мака более чем в 3-4 раза. Оптимальными концентрациями парафторфенилаланина в указанных способах стимуляции регенерации являются: в культуре тканей табака 100 мг/л, в культуре тканей мака прицветникового 10 мг/л.

5

0

0

Формула изобретения

Применение парафторфенилаланина в качестве стимулятора эмбриогенеза в культуре растительных тканей.

Коэффициент эмбриогенеза рассчитывали как отношение учтенных эмбрио- идов к общему числу субкультур данного варианта.

Составитель В.Демкин Редактор Н.Яцола Техред М.Дидык Корректор А.Обручар

Заказ 470

Тираж 487

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Таблица 1

Подписное