Способ получения W-интерферона человека Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 C12P21/00 

1

(21)4355228/30-13

(62) 3935002/28-14

(22)19.02.88

(23)31.07.85 (3t) F 34283/06

(32)01.08.84

(33)DE

(46) 15.03.90. Бюл. № 10

(71) Берингер Ингельгайм Интернацио наль ГмбХ (DE)

(72) Рудольф Гауптманн, Петер Мейндль, Эва Растль-Дворкин, Понтер Адольф, Петер Светлы, Кристиан Пилер (AT)

и Норберт Гауэль (DE)

453) 575.224.2(088.8)

«(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ W-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА

(57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения интерферона. Способ получения W-интер- ферона заключается в том, что трансформированный рекомбинатной плазми- дой nHK pY-JDB-HuJFNW штамм дрожжей ШЗ-С2 инкубируют, центрифугируют при 5000 g в течение 5 мин, суспендируют в растворе гуанидин хлорида, добавляют стеклянные шарики с последующим встряхиванием, надосадочную жидкость инкубируют и объединяют с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим гуанидин хлорид, с последующим центрифугированием при 12000 g в течение 1 мин.

Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения интерферона. Способ получения W - интерферона заключается в том, что трасформированный рекомбинантной плазмидой ДНК-PY-JDB-HUIFNW штамм дрожжей СМЗ-С2 инкубируют, центрифугируют при 5000G в течение 5 мин, суспендируют в растворе гуанидин хлорида, добавляют стеклянные шарики с последующим встряхиванием, надосадочную жидкость инкубируют и объединяют с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим гуанидин хлорид, с последующим центрифугированием при 12000G в течение 1 мин.

Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения интерферона.

Способ получения W-интерферона за- iключается в том, что трансформированный рекомбинантной плазмидой ДНК pY- JDB-HuJFNW штамм дрожжей СМЗ-С2 инкубируют, центрифугируют при 5000 g в течение 5 мин, суспендируют в растворе гуанидин хлорида, добавляют стеклянные шарики с последуюшим встряхиванием, надосадочную жидкость инкубируют и объединяют с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим гуанидин хлорид, с последующим центрифугированием при 12000 g в течение 1 мин.

В примерах 1,2 используют среды следующего состава. YNB+CAA- среда (1 л), г:

YNB без аминокислот6,7

Кас-аминокислота5

Вода

УРД-среда (1 л), г:

Дрожжевой экстракт, г 1Q Бакт-пептон, г20

Вода

50 х минус Leu-раствор (100 мл), г:

Триптофан0,25

0,20

Аргинин

Гистидин

Изолейцин

Лизин

Метионин

Фениланилин

Треонин

Аденин

О, tO 0,60 Я,40 0,10 0,60 0,50 0,12

сд

СД

ю

СД

ы

155 0,24

.Урацил Вода

Стерильная фильтрация.

Сорбитные пластинки (600 мл), г: Сорбит109,2

Глюкоза12,0

YNB-4; 02

Агар15

Вода

Обрабатывают в автоклаве и охлаждают до 4Ь°С, затем добавляют 50 х минус Leu-раствора и изготовляют пластинки.15

Топ-агар (1 л), г:

Сорбит

Глюкоза

YNB

Агар

Вода втоклавная обработка.

SE1) (25 мл), мл:

2 М сорбит

0,5 М этилендинйтрилотетрауксусная кислота

(ЭДТУК)

Дистиллированная вода

ДТТ (дитиотрейтол) Стерильная фильтрация. SCE (25 мл), мл: 2 М сорбит

0,5 М цитрат тринатрия 0,5 М ЭДТУК Стерильная дистиллированная вода CAS (25 мл), мл: 2 М сорбит 100 мМ хлористый кальций

1 М трис; рН 7,5 Стерильная дистиллированная вода Раствор ПЭГ (20 мл), мл: Полиэтиленгликоль с м.в-. 4000, г 100 мМ хлористый кальций

1М трис; рН 7,5 Дистиллированная вода

Стерильная фильтрация SOG (5 мл), мл:

2М сорбит

УРД

100 мМ хлористый

кальций

182 20

6,7 25

12,3

20

25

1,25 11,25 192,75 30

12,5 5,0 0,5

7,0 12,5

2,5 0,25

9,75

2

0,2 17,8

2,5 1,7

0,3

35

40

45

50

55

0

5

0

5

0

35

40

45

50

55

50 х минус Leu-раствор, мкл12,5

Дистиллированная вода 0,5

Стерильная фильтрация.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Приме р 1. Конструирование плазмиды pY-JDB-HuJFNW1.

А. Получение фрагмента промотора ADHI.

80 мкг плазмиды pES 103 переваривают с BamHI и Xhol эндонуклеазами в 500 мкл раствора. Промотор длиной около 1400 пар оснований (п.о.) отделяют от вектора на 1%-ном агаровом геле, выделяют из геля электроизоля- цией и осаждают. Фрагмент поглощают в 40 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис, 1 мМ ЕДТУК, ).

Б. Подготовка вектора pJDB 207.

10 мкг известной плазмиды pJDB 207 разрезают с помощью BamHI в 100 мкл раствора, линеаризуя ее. С целью предотвращения последующей религации 5 -концевые фосфатные группы удаляют путем обработки фосфатазой телячьего кишечника. Линейную форму отделяют на 1%-ном агаровом геле от неразрезанной плазмиды, выделяют электро- элюацией и осаждают. Векторную ДНК растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера.

50 мкл плазмиды pRHW 12 линеаризуют с помощью Hind III в 600 мкл раствора. Путем добавления фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 (10 единиц) и четырех дезоксинуклеозидтрифосфа- тов (по 25 мкм) и инкубации при комнатной температуре 5 -выступающие концы превращают в прямые концы. Линейную форму плазмиды очищают путем электрофореза на агаровом геле и последующего выделения. Фрагмент растворяют в 50 мкл ТЕ-буфера. Для получения соединяющихся с фрагментом прото- тора концов к концам линейного pRHW 12 присоединяют Xho 1-линкеры, для чего 3 мкл Xho 1-линкера (формула d CCTCGAGG) фосфорилируют 5 ед. 14- полинуклеотидкиназы и гАТР; после инактивации энзима нагреванием в течение 10 мин при 70°С 5 мкл этого раствора объединяют с 10 мкл линейной формы плазмиды pRHW 12; 20 мкл реакционного раствора лигируют с Т4-ДНК-лигазой (16 ч при 14°С). Лигазу инактивируют путем обработки в течение 10 мин при 70°С и доводят объем реакционного раствора до 150 мкл добавлением буфе515512516

pa A (10 mM трис, ,6, 50 мМ хло-при 30°С. Клетки еще раз центрифугиристого натрия, 10 мМ хлористого магния).

руют (в течение 6 мин при 2500 об. /мин) и повторно суспендируют в 10 мл SCE.

Путем обработки 100 ед. Xhol удаЗатем добавляют 100 мкл глузулазы (/3-глукоронидазы, арилсульфатазы) и

ляют специфичные относительно Xhol 5 -выступы. Снабженную Xhol-концами линейную плазмиду pKHW 12 очищают путем электрофореза на агаровом геле и электроэлюации из геля. Перед осажде-10 которые отделяют центрифугированием нием добавляют 5 мкл фрагмента промо- (5 мин ПРИ 200° об./мин) с последую- тора. После осаждения молекулы ДНК поглощают в 14,5 мкл ТЕ-буфера и после добавления буфера лигирования и 5 ед. Т4-ДНК-лигазы лигируют в тече- 15 с 6 мкг плазмиДной Днк (pY-JDB-Hu- ние 16 ч при 14°С. После термическойJFNW1) и инкубируют в течение 15 мин

инактивации энзима объем раствораПРИ комнатной температуре. После додоводят до 200 мкл добавлением упомянутого выше буфера А и режут ДНК с помощью BamHI. Желаемую ДНК получают 20 г

инкубируют в течение 30 мин при 30 С При этом получают сферобласты,

щей промывкой CAS и повторным суспен- дированием в 500 мкл CAS.

120 мкл сферобластов смешивают

очисткой агаровым гелем и растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера.

Готовую плазмиду получают лигиро- ванием 5 мкл фрагмента BamHI (промотор и ген интерферона Wf) с 1 мкл линеаризованного вектора pJDB B207 в 10 мкл раствора в присутствии 1 ед. Т4-ДНК-лигазы.

10 мкл компенентных клеток штамма E.coli HB 101 трансформируют путем добавления 5 мкл раствора продукта лигирования и культивируют на LB-агаровых пластинках, содержащих tOO мкг/мл ампициллина.

Произвольно выбирают 12 из полученных клонов и -выделяют содержащиеся в них плазмиды в малом масштабе (объем культуры 1,5 мл). После обработки этих плазмид с помощью различных рестрикционных энзимов и электрофореза на агаровом геле выбирают плазмиду, имеющую желаемую конструкцию, и обозначают ее как pY-JDB-Hu-JFNW1.

П р и м е р 2. Получение W-интер- ферона,

А.Трансформация дрожжей..

25 мл УРД + минус Leu-раствора инокулируют дрожжевой колонией (штамм GM3-C2). Культуре дают расти в течение ночи при 30°С. 100 мл УРД+ +минус Leu-раствора инокулируют 100 мкл полученной предварительной . культуры и дают расти при 30 С до оптической плотности 1 при 600 .нм (около 4x107 клеток/мл). Дрожжевые клетки удаляют центрифугированием (в течение 5 мин при 5000 об./мин). Клетки повторно суспендируют в Ю мл SED и инкубируют в течение 10 мин

25

30

35

40

45

50

55

б явления 1 мл раствора ПЭГ инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем клетки отделяют центрифугированием (5 мин при 2000 об. /мин) Клетки повторно суспендируют в 150 мкл SOG-раствора и инкубируют в течение 30 мин при 30°С. Затем добавляют 5 мл Топ-агара + 250 мкл 50 х минус Leu-раствора и наносят клетки на сор- битные пластинки. По истечении 2- 4 дней инкубации при 306С развиваются колонии. Б.Получение интерферона.

25 мл YNB + САА среды + 1 мл 50%-ной глюкозы + 1 мл 50 х минус Leu-раствора инокулируют трансформированной дрожжевой колонией. Продолжительность инкубации составляет по меньшей мере 40 ч при 30 С. 13 мл этой культуры центрифугируют в тече- ние 5 мин при 4500 об./мин. Центрифу- гат суспендируют в 0,5 мл 2М гуани- дин хлорида и после добавления 2 мл стеклянных шариков (диаметр 0,4- 0,5 мм) интенсивно встряхивают в течение 10 мин при 4°С. Затем надосадоч ную жидкость переливают в другую емкость и инкубируют при О С. Стеклянные шарики промывают 0,5 мл 7 М гу анидин хлорида и объединяют полученный рйствер с надосадочной жидкостью., , Раствор центрифугируют в течение i 1 мин при 12000 об./мин. Надосадоч- ная жидкость содержит 1x108 ед. JFNWI/л дрожжевой культуры.

П р и м е р 3. А, Повторяют пример 1 с той лишь разницей, что вместо плазмиды pRHW 12 используют плазмиду pRHW 11, вместо плазмиды р9А2 ис пользуют плаэмиду Е76Е9. При этом получают экспрессионный вектор pY-JDB- HuJFNW2.

при 30°С. Клетки еще раз центрифугируют (в течение 6 мин при 2500 об. /мин) и повторно суспендируют в 10 мл SCE.

Затем добавляют 100 мкл глузулазы (/3-глукоронидазы, арилсульфатазы) и

которые отделяют центрифугированием (5 мин ПРИ 200° об./мин) с последую- с 6 мкг плазмиДной Днк (pY-JDB-Hu- JFNW1) и инкубируют в течение 15 мин

инкубируют в течение 30 мин при 30 С. При этом получают сферобласты,

которые отделяют центрифугированием (5 мин ПРИ 200° об./мин) с последую- с 6 мкг плазмиДной Днк (pY-JDB-Hu- JFNW1) и инкубируют в течение 15 мин

щей промывкой CAS и повторным суспен- дированием в 500 мкл CAS.

120 мкл сферобластов смешивают

ПРИ комнатной температуре. После до0 г

5

0

5

0

5

0

5

б явления 1 мл раствора ПЭГ инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем клетки отделяют цент( рифугированием (5 мин при 2000 об. /мин). Клетки повторно суспендируют в 150 мкл SOG-раствора и инкубируют в течение 30 мин при 30°С. Затем добавляют 5 мл Топ-агара + 250 мкл 50 х минус Leu-раствора и наносят клетки на сор- битные пластинки. По истечении 2- 4 дней инкубации при 306С развиваются колонии. Б.Получение интерферона.

25 мл YNB + САА среды + 1 мл 50%-ной глюкозы + 1 мл 50 х минус Leu-раствора инокулируют трансформированной дрожжевой колонией. Продолжительность инкубации составляет по меньшей мере 40 ч при 30 С. 13 мл этой культуры центрифугируют в тече- . ние 5 мин при 4500 об./мин. Центрифу- гат суспендируют в 0,5 мл 2М гуани- дин хлорида и после добавления 2 мл стеклянных шариков (диаметр 0,4- 0,5 мм) интенсивно встряхивают в течение 10 мин при 4°С. Затем надосадоч- ную жидкость переливают в другую емкость и инкубируют при О С. Стеклянные шарики промывают 0,5 мл 7 М гу- анидин хлорида и объединяют полученный рйствер с надосадочной жидкостью., , Раствор центрифугируют в течение i 1 мин при 12000 об./мин. Надосадоч- ная жидкость содержит 1x108 ед. JFNWI/л дрожжевой культуры.

П р и м е р 3. А, Повторяют пример 1 с той лишь разницей, что вместо плазмиды pRHW 12 используют плазмиду pRHW 11, вместо плазмиды р9А2 используют плаэмиду Е76Е9. При этом получают экспрессионный вектор pY-JDB- HuJFNW2.

Б. Повторяют пример 2 с той лишь разницей, что трансформацию дрожжей осуществляют с использованием экс- Прессионного вектора pY-JDB-HuJFNW2.

El

При этом получают 1х10еец. интерферона Ґ2,

JFNW2 отличается от JFNW1 лишь заменой кодирующего III-ю аминокислоту кодона GGG на кодон GAG (кодирующий fлутаминовую кислоту).

Л р и м е р 4, Опыты по определению антивирусной активности.

А Антивирусная активность на человеческие клетки.

Линия клеток: человеческая линия клеток рака легкого А549/(АТСС CCL 185),

Вирус; мышиный вирус энцефаломиокардита.

Тест-система: подавление цитопати ческого эффекта (все титрования осуществлялись четырехкратно) .

Интерферон по примерам 2 и 3 титруют в пригодном разбавлении в ука рапной тест-снст ме. Препарат покапывает ярко выраженную антивирусную активность при удельной активности 8300 международных частиц/мг в расче- fe на стандарт (Go-23-901-527). Известные человеческие интерфероны ти- (13 о/, /3й - показывают такую же антивирусную активность только при удельной активности 3700, 9000 и 8800 меж- Дународных единиц/мг- соответственно. Е./штипролиферативная активность на человеческие клетки.

Человеческую линию клеток Daudi

выращивают Б присутствия человеческого интерферона по примерам 2 и 3 и

,

10

15

-- 5

40 20

25

30

известных человеческих интерферонов типа d, (Ь и у, которые использовались в различных концентрациях. Через шесть дней инкубации при 37 С определяют плотность клеток. Необработанные культуры служат в качестве контроля. Все культуры приготавливают трехкратно и испытывают параллельно. При этом обнаружено, что ярко выраженное подавление пролиферации клеток обеспечивает интерферон примеров 2,3 в количестве 100 международных единиц, а интерфероны типов я/, /з и -и- в количестве 110,125 и 130 международных единиц соответственно.

Сравнение результатов опытов А и Б свидетельствует о том, что новый W-интерферон проявляет ту же антивирусную активность, что и известные интерфероны типов oi, р и -yt но при меньшей концентрации, т.е. он обладает лучшей антивирусной активностью.

Формула изобретения

Способ получения W-интерферона человека, включающий трансформацию штамма Saccharomyces cerevisial СМЗ-С2 рекомбинантной плазмидой ДНК- pY-JDB-HuJFNW, инкубацию трансформированных клеток, разрушение клеточных стенок центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин, суспендирова- ние в 2 М гуанидин хлориде, добавление стеклянных шариков с последующим встряхиванием, инкубацию надосадоч- ной жидкости и объединение с раствором промывки стеклянных шариков, содержащим 7 М гуанидин хлорида, с по- сле(дующим центрифугированием при 12000 g в течение 1 мин.