Штамм культивируемых гибридных клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител против альфа-фетопротеина человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/06 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для определения альфа-Фетопро- теина (АФП) иммунорадиометрическим методом.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к АФП человека и не реагирующие с АФП животных.

МонАТ -штамма реагирует с детерми- нантой АФП, присутствующей только в АФИ человека, и не связывается с АФИ мыши, крысы, теленка, собаки, свиньи и коыки.

Штамм получают следующим образом„

Мышей линии BALB/c иммунизируют очищенным препаратом АФП человека.

Антиген вьщеляют из смеси сывороток больных с гепатоцеллюлярным раком и тератобластомой методом аффинной хроматографии с использованием кроличьих антител к АФП, конъюгирован- ных с CHBr-активированной сефаро- зой 4В. Окончательную очистку антигена проводят методом аффинной хроматографии с использованием кроличьих антител к белкам сыворотки взрослого человека - эту процедуру повторяют дважды, что обеспечивает высокую (более 95%) чистоту выделяемого антигена. Чистйту контролируют с кроличьей антисывороткой к белкам сыворотки человека методом двойной иммунодиффузии в геле. Полученный препарат смешивают 1:1 с полным адъювантом Фрейнда. Каждой

00

sl

Cfc

J1631076л

дят 15 мкг АФИ в объеме 0,3 мл в иесть коротки, 2 мМ глютаминп, 100 мкг/мл точек, подкожно на спине (4 то«ки геьтамицина, при 37°С в присяге по 0,05 мл) и внутримышечно в задние 5% С02 (в пластинах) или беч С0„

ноги (2x0,05 мл). Через месяц мыши вводят 75 мкг АФП без адъюванта Фрейнда внутривенно (0,2 мл) и внут- рибрюшинно (0S2 мл). На четвертый день после второго введения антигена берут селезенку и суспензию спленоци- тов гибридизуют с мышиной миеломой Х-63. Ag 8.653. Для этого смесь спле- ноцитов и миеломы (6,5:1) в виде осадка инкубируют с 3 мл полиэтилейгликоля (М.в.1500) в течение 2 мин. Обработанную смесь клеток высевают в две 96-луночные пластины без Фидера из расчета 4x10 сплено- цитов в лунку или 4,6x10J смеси клеток в лунку. Клетки культивируют в среде ДМЕМ с добавлением 20% лошади- ной сыворотки, 2мМ глютамина, 100 мкг/мл гентамицнна. Селекцию ги- ридных клеток проводят в культураль- ной среде в присутствии гипоксантина (13,6 мкг/мл) аминоптерина (0,1 9 мкг/мл) и тимидина (3,9 мкг/мл). Появление

10

i5

20

(з плотно закрытой посуде). Для выращивания штамма можно использовать стеклянную или пластиковую посуду. Во флакон емкостью 25 см3 засевают в 7 мл ростовой среды 5х105- 10б клеток штамма 1)10-84. Пассирование проводят один раз в 3-4 дня той же дозой клеток (без подсчета клеток их рассеивают из одного флакона на три), Титр антител в культуральной среде при определении имму.чооерментным методом равен 2x1 О3.

Для культивирования in vivo мышам BALB/cs сенсибилизированным приста- ном (0,5 мл внутрибрюшинно) за 7 дчей до прививки гибридом, вводят внутрибрюыинно 5х10б-107 клеток штамма D10-84 в 2 мл среды RPMI с гента- мицином. Асцитическую жидкость забирают у живых мышей, по мере ее на- 2С колления, повторяя забор асцита у одной и той же мыши не менее 3 раз о Асцитный штамм перевивают на свежих

колоний гибридных клеток зарегистриро- мышей (5x10 -10 клеток на мышь), про- вано на 7-й день после слияния. На водя не более трех пассажей. В пулах

(з плотно закрытой посуде). Для выращивания штамма можно использовать стеклянную или пластиковую посуду. Во флакон емкостью 25 см3 засевают в 7 мл ростовой среды 5х105- 10б клеток штамма 1)10-84. Пассирование проводят один раз в 3-4 дня той же дозой клеток (без подсчета клеток их рассеивают из одного флакона на три), Титр антител в культуральной среде при определении имму.чооерментным методом равен 2x1 О3.

Для культивирования in vivo мышам BALB/cs сенсибилизированным приста- ном (0,5 мл внутрибрюшинно) за 7 дчей до прививки гибридом, вводят внутрибрюыинно 5х10б-107 клеток штам

ма D10-84 в 2 мл среды RPMI с гента- мицином. Асцитическую жидкость забирают у живых мышей, по мере ее на- колления, повторяя забор асцита у одной и той же мыши не менее 3 раз о Асцитный штамм перевивают на свежих

Изобретение относится к гибри- домной технологии и может быть использовано для определения аль сра- фетопротеина (АФП) иммунорадиометри- ческим методом. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. , продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к АФП человека и не реагирующих с АФП животных, Ытамм получают гибридизацией клеток миеломы Х63. АИ 8.653 спленоцитами мышей, иммунизированных очищенным АФП человека- Итамм депонирован под ВСКК(И) № 349D. Ытамм культивируют в среде ДМ ЕМ или RPMI 164 Г) с 15% сыворотки эмбриона коровы и стандартными добавками при 5% СО г в воздухе. Клетки пересевают через 3-4 сут с начальной плотностью (1-2)к10 кл/мл. Клетки культивируют in vivo в виде асцитной опухоли у сингенных мышей. Клетки продуцируют монАТ класса IgG1. Титр монАТ в асцитных животных достигает 10 при определении методом EL1SA, с to

13-й день после слияния множественные колонии (3-5 на лунку) выросли в 100% засеянных лунок. Скрининг проводят иммуноферментным методом с ис30

пользованием конъюгата кроличьих антител IgG мыши с пероксидазой хрена.

40

асцитов, полученных от разных животных и в разных взятиях, титр антител при определении иммуноферментным методом достигает значения 10 .

Продуктивность штамма. R 1 мл культуральной среды содержится не более

В 99% лунок в супернатантах обнаруже- 35 10-20 мкг/мл антител, а в асцитичесна специфическая анти-АФП активность, кой жидкости не менее 5 мг/мл антиКлонирование и субклонирование пози- тел.

.тивных гибридом проводят методом лимитирующих разведений, осуществляя

посев гибридом в количестве 3,1 и

0,5 клеток в лунку с заранее приготовленным фидером. В качестве фидера

используют клетки перитопеального

экссудата мышей BALB/c (5x103 клеток

в лунку). Клонирование проводят на

культуральной среде, содержащей 15%

эмбриональной телячьей сыворотки

При реклонировании отмечается 100%

позитивных клонов.

Полученный штамм гибридных клеток 50

обозначен D10-84 и депонирован под

номером BCKK(II) № 349Г).

Контаминация. Контаминация бактериями и грибами в штамме не обнаружена.

Криоконсервированйе. Клетки штамма ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из эмбриональной 45 телячьей сыворотки, ЦМЕМ или RPMI 1640 и диметилсульфоксида (5:4:1). 5x106 клеток штамма смешивают с 1 мл такой среды на холоде в пластиковых пробирках, для чего последние держат на льду и сразу же после программного замораживания материала (1°/мин) помещают в хранилище с жидким азотом. Хранение в жидком азоте в течение нескольких лет обеспечивает почти 90%-ную выживаемость клеток (визуальная оценка), Клетки штамма выдерживают хранение и при -70 С, но короткое во времени(до 1 мес.). Размораживание штамма проводят те я л чнс й бане

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Кулвтуральные свойства.

Гибридому культивируют в среде (рН 7,2) ДМЕМ или RPMT 16405 содержащей 15% эмбриональной телячьей сы

Контаминация. Контаминация бактериями и грибами в штамме не обнаружена.

Криоконсервированйе. Клетки штамма ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки, ЦМЕМ или RPMI 1640 и диметилсульфоксида (5:4:1). 5x106 клеток штамма смешивают с 1 мл такой среды на холоде в пластиковых пробирках, для чего последние держат на льду и сразу же после программного замораживания материала (1°/мин) помещают в хранилище с жидким азотом. Хранение в жидком азоте в течение нескольких лет обеспечивает почти 90%-ную выживаемость клеток (визуальная оценка), Клетки штамма выдерживают хранение и при -70 С, но короткое во времени(до 1 мес.). Размораживание штамма проводят те я л чнс й бане

при S7°C в течение 2-3 мин, поело ЧСТР клетки отмывают центрифугированием от среды для замораживания и переводят в обычную культуральную среду.

Характеристика целевого продукта. МонАТ, продуцируемые штаммом D10-84, относятся к субклассу 1дС1. Константа связывания антител штамма D10-84 с АФП равна 1 ,8x1 л/моль - определение проведено жидкофазным конкурентным радиоиммунологическим методом. Взаимодействие МонАТ с АФП определяется иммуноферментным и радииммунологическим методами, а также методами иммуноизотахофореза на аце- татцеллюлозной мембране и смешанной преципитации в геле, МонАТ П10-84 связывается с АФП, находящимся в расворе и иммобилизованным на твердой фазе, а также и в том случае, когда само МонАТ D10-84 прикреплено к носителю, например пластику По методу двойной иммунодиффузии в геле МонАТ D10-34 не преципитирует АФП. При анализе с различных видов млекопитающих МонАТ D10-84 реагирует только с АФП человека и по результатам иммуноферментного анализа отличается более выраженным сродством к АФН от больных с первичным раком печени по сравнению с АФП тератоблас- томного или эмбрионального происхождения .

Пример. Использование МонАТ D10-84 в смеси с МонАТ С2 на твердой фазе для и мунорадиометрического определения АФП.

Твердой подложкой служит поверхность лунок полихлорвиниловых плат. Для иммобилизации МонАТ в лунках инкубируют смесь асцитических жидкосте D10-84 и С2-84 в 0,08 М растворе (200 мкл) при комнатной- температуре в течение 9-12 ч. Конечное разведение асцитических жидкостей D10-84 и С2-84 в лунках равно 1:2000-1:3000. После удаления содержимого лунки двукратно промывают за- буференным физиологическим раствором (ЗФР), рН 7,3-7,5, содержащем 1-2% лошадиной сыворотки (ЗФР-ЛС). Блокировку свободных участков полихлорвинила проводят с помощью третьей порции ЗФР-ЛС (230 мкл) в течение 1,5- 2 ч при комнатной температуре. После 2 -3-кратной промывки под струей водопроводной воды лунки с иммобилизировачыми МонЛТ используют в качество тигр дои фазы.

Для сравнительной оценки эффективности связывания смеси МонАТ D10-84 и С2-84 аналогичным образом готовят твердую фазу с МонАТ D10-84 и С2--84, взятыми отдельно. Конечное разведение асцитических жидкостей D10 и С2 рав- но 1:1300-1:2000.

Пригодность твердой фазы определяют путем построения кривой стандартов АФП. Для этого используют стандар5 ты.АФП из коммерческого набора или амниотическую жидкость с известным содержанием АФП, а также меченные

1 кроличьи антитела к АФП и буф ер- ный раствор из набора или ЗФР-ЛС.

0 Иммунорадиометрическое определение АФП проводят в два этапа. Сначала в лунках с иммобилизованными МонАТ инкубируют стандарты АФП (180 мкл) при комнатной температуре (не менее

5 9-12 ч) пли при 37°С (3-4 ч). Затем содержимое лунок удаляют и лунки промывают 3-5 раз под струей водопроводной воды. На втором этапе связавшийся твердой Фазой АФП проявляют

о мечеными антителами (200 мкл) в течение 16-20 ч при комнатнбй температуре или 37 С. Содержимое лунок отсасывают в сборник радиоактивных отходов . Лунки промывают 3-5 раз под струей водопроводной воды, плату высушивают на воздухе и разрезают. Вырезанные лунки помещают в счетные пробирки для счета. Определив скорость счета (имп/мин) в объеме 200 мкл .„ (Т - общая метка), для каждого станU

дарта рассчитывают величину связывания метки (В/Тх100%) и строят калибровочную кривую.

При использовании смеси монАТ

,r D10-84 и С2-84 на твердой фазе определяемая концентрация АФП лежит в диапазоне от 1-5 до 80 нг/мл, тогда как использование тех же МонЛТ по отдельности в данном методе обеспечиQ вает неудовлетворительную чувствительность определения.

Формула изобретения

е. Ытамм культивируемых гибридных клеток животных Mus nmsculus L.BCKK (II), № 349D, продуцент моноклональ- ных антител против альйа-фетопротеи- на человека..

5