Штамм культивируемых гибридных клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител против альфа-фетопротеина человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к гибри- домной технологии и может быть использовано для определения содержания альфа-фетопротеинч. (АФП) в биологических жидкостях.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующего к АФП человека и животных.

МонАТ штамма реагирует с АФП человека, мыши, теленка, свиньи и кошки и не реагирует с АФП собаки и крысы.

Штамм получают следующим способом.

Мышей линии BALB/c иммунизируют очищенным препаратом АФП человека. Антиген выделяют из смеси сывороток больных с гепатоцеллюлярным раком и тератобластомон методом аффинной хроматографии с использованием кроличьих антител к АФП, конъюгирован- Hbix с СЫВг-активировэнной сефаро- зой 4В. Окончательную очистку антигена проводят методом аффинной . хроматографии с использованием кроличьих антител к белкам сыворотки взрослого человека - эту процедуру повторяют дважды, что обеспечивает высокую (более 95%) чистоту выделяciioro антигена. Чистоту АФН контролируют с гфоличьей антисывороткой к белкам сыворотки человека методом двойной иммунодиффузии в геле. Полученный препарат смешивают 1:1 с полным адъювантом Фреймда. Каждой мыши вводят 15 мкг АФП в объеме 0,3 мл а шесть точек: подкожно на спине „4 точки по 0,05 мл) и внутримышечно в задние ноги (2x0,05 мл). Через месяц вводят 75 мкг АФП без адъю- ванта Орейнда внутривенно (0,2 мл) и внутрибрюшинно (0,2 мл). На четвертый день после второго введения . антигена берут селезенку и суспензию спленоцитов гибридизуют с мы-1- шиной миеломой Х-63 А.д 8.653. Для этого смесь спленоцитов и миеломы (6:5:1) в виде осадка инкубируют с 3 мл 50% гюлиэтиленгликоля (М„в. 1500 фирмы Merck-Schuchardt) в течение I мин. Обработанную смесь клеток ллсевают в две 96-луночные пластины (Falcou 3040) без фидера из расче- 1.1 4х|0 спленоцитов в лунку или + , смеси клеток в лунку. Клетки культивируют в среде DMEM с добавлением 20% лошадиной сыворотки, 2 мМ глютамина, 100 мкг/мл гентамицина. Селекцию гибридных клеток проводят в культуральной среде в присутствии гппоксантина (13,6 мкг/мл), аминоп- терина (0519 мкг/мл) и тимндила (3,9 мкг/мл). Появление колоний гибридных клеток зарегистрировано на 7-й день после слияния. На 13-й день noi-ле слияния множественные колонии (3-5 на лупку) выросли в 100% засеянных лунок. Скрининг проводят иммуно- ферментным методом с использованием конъюгата кроличьих антител к IgG мыши с пероксидазой хрена. В 99% лунок в супернатантах обнаружена специфическая анти-АФП активность. Клонирование и субклонирование позитивных гибридом проводят методом лимитирующих разведений, осуществляя посев гибридом в количестве 3,1 и 0,5 клеток в лунку с заранее приготовленным фидером. В качестве фидера ис пользу- ют клетки перитонеального экссудата мышей BALB/c (5-103 клеток в лунку). Клонирование проводят на культуральной среде, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки. При рек- лонировании отмечалось 100% позитив- ,ных клонов.

Полученный штамм гибридных клеток обозначен С2-84 и депонирован под номером ВСКК (II) N 346D.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Гибридому культивируют в среде (рН 7,2) DMEI1 или RPMI 1640, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 100 MIC г/мл гентамнцина, при 37°С в присутствии 5% СО (в пластинах) или без СО (в плотно закрытой посуде)„ Для выращивания штамма можно использовать стеклянную или пластиковую посуду. Во флакон емкостью 25 см3 засевают в 7 мл ростовой среды -10 клеток штамма С2-84. Пассирование проводят один раз в 3-4 дня той же дозой кле0 ток (без подсчета клеток их рассеивают из одного флакона на три), Титр антител в культуральной среде при определении иммуноферментным методом равен 2 Ю3.

5 Для культивирования in vivo мышам BALB/c, сенсибилизированным прис- таном (0,5 мл внутрибрюшннно) за 7 дней до прививки гибридом, вводят внутрибрюшинно 510 -10 клеток штам0 ма С2-84 в 2 мл среды RPMI с гентами- цином. Асцитическую жидкость забирают у живых мышей по мере ее накопления, повторяя забор асцита у одной и той же мыши не менее 3 раз. Асцит - ный штамм перевивают на свежих мышей (510 -10 клеток на мышь), проводя не более трех пассажей. В пулах асцитов, полученных от разных животных и в разных взятиях, титр антител при

0 -определении иммуноферментным методом достигает значения 10 .

Модальное число хромосом 79. Продуктивность штамма. В 1 мл культуральной среды содержится не

5 более 10-20 мкг антител, а в асцити- ческой жидкости не менее 5 кг/мл антител.

Контаминация. Контаминация бактериями и грибами в штамме не обнаружена.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки, DMEM или RPMI 1640 и диметилсульфоксида (5:4:1). 5 40 клеток штамма смешивают с 1 мл , такой среды на холоде в пластиковых пробирках, для чего последние держат на льду и сразу же после программного

0

5163

замораживания материала (1°/мин) помещают в хранилище с жидким азотом. Хранение в жидком азоте в течение нескольких лет обеспечивает почти .90% выживаемость клеток (визуальная оценка). Клетки штамма выдерживают хранение и при -70°С, но короткое по времени (до 1 месяца). Размораживание штамма проводят

в водяной бане при 37 С в течение 2-3 мин, после чего клетку отмывают центрифугированием от среды для замораживания и переводят в обычную культуральную среду.

Характеристика целевого продукта.

МонАТ, продуцируемые штаммом С2-84 относятся к подклассу мышиных иммуноглобулинов Ig01. Константа связы- вания антител штамма С2-84 с №11 равна л/моль. Определение проведено жидкофразным радиоиммунологическим методом. Вза){модействие МонАТ с АФП может быть определено имму-

ноферментным и радиоиммунологичегким методами, а также методом иммуноизо- тахосЬореза на ацетатцеллюлозной мембране и методом смешанной преципитации в геле. МонАТ G2-84 способны связываться с АФП, находящимся в , растворе и иммобилизованным на твердой фазе, а также и в том случае, когда само МонАТ С2-84 прикреплено к носителю, например, к пластику. В методе двойной иммунодиффузии в геле МонАТ С2-84 АФП не преципитиру- ет. Т1ри анализе с АФП различных видов млекопитающих МонАТ С2-84 реагирует с с АФП человека, мыши, теленка, свиньи и кошки и не реагирует с АФП крысы и собаки. По результатам иммунофер- ментного анализа С2-84 обладает практически одинаковым сродством к АФП от больных первичным . раком печени и к АФП эмбрионального происхождения. С ЛФП от больных с тератобластомами МонАТ С2-84 связывается несколько слабее. С антигеном связывается в присутствии МонАТ D10- 84 и F2-84, что свидетельствует об отсутствии перекрестной реактивности между данными МонАТ.

Использование штамма С2-84 иллюстрируется следующим примером.

Пример. Использование МонАТ С2-84 в смеси с другим МонАТ D10-84 в иммунорадиометрическом методе для определения АФП.

JQ

15

20 25

30 д 0

5

b6

Смесь двух МснАТ сорбируется на твердой Аазе.

Твердой подложкой служит поверхность лунок полихлорвиниловых плат. Для иммобилизации МонАТ в лунках инкубируют смесь асцитическпх жидкостей С2-34 и D10-84 в 0,08 М растворе (20° мкл) при комнатной температуре в течение 9-12 ч. Конечное разведение асцитнческих жидкостей С2-34 и D10-84 в лунках равно 1:2000- 1:3000. После удаления содержимого . лунки двукратно промывают забуферен- ным физиологическим раствором (ЗФР) рН 7,3-7,5, содержащим 1-2 лошадиной сыворотки (ЗФР-ЛС). Блокировку свободных участков полихлорвинила проводят с помощью третьей порции ЗФР-ЛС (230 мкл) в течение 1,5-2 ч при комнатной температуре После 2-3-кратной проьывки под стру-- ей водопроводной воды лунки с нммо- бшшзованнымн МонАТ используют в качестве твердой фазы.

Для сравнительной оценки эффективности связывания смеси МонАТ С2-84 и D10-84 аналогичным образом готовят твердую Лазу с МонАТ D10-84 и С2-84 отдельно. Конечное разведение амниотических жидкостей С2-84 и D10-84 равно 1:1300-1:2000.

Пригодность твердой фазы определяют путем построения кривой стандартов ЛVII. Для этого используют стандарты ЛФП из коммерческого набора или амчиотическую жидкость с известным содержанием ЛФП. а также Me-J

1/2 с

ченныеI кроличьи антитела к АФП

и буферный раствор из набора или ЗФР-ЛС.

Иммунораднеметрическое определение АФП проводят в два этапа. Сначала в лунках с иммобилизованными МонАТ инкубируют стандарты АФП (180 мкл) при комнатной температуре (не менее 9- 12 ч) или при 37 С (3-4 ч). Затем содержимое лунок удаляют и лунки промывают 3-5 раз под струей водопроводной воды. На втором этапе связавшийся твердой фазой АФП проявляют мечеными антителами (200 мкл) в течение 16-20 ч при комнатной температуре или при 37 С. Содержимое лунок отсасывают в сборник радиоактивных отходов. Лунки промывает 3-5 раз под струей водопроводной воды, плату высушивают на воздухе и разрезают. Вырезанные лунки помещают в счетные

пробирки для X1-счета. Определив скорость счета (имп/мин) в объеме 200 мкл (Т - общая метка), для каждого стандарта рассчитывают величину связывания метки (В/Т Ч 00%) и строят калибровочную кривую.

При использовании смеси МонАТ С2-84 и D10-84 в качестве твердой фазы определяемая концентрация АФП лежит в диапазоне от 1-5 до 80 нг/мл, тогда как те же МонАТ, взятые по от

дельности существенно уступают в - данном методе по чувствительности определения АФП смеси МопЛТ,

Формула изобретения

Штамм культивируемых гибридных, клеток животных Миз ти.;ги1из L. ВСКК (II) № 346D - продуцент моноклопальных антител против альфа-фетопротеи- на человека.

Изобретение относится к гибри- домной технопогин и может быть использовано для определения альфа- фетопротеина (АФИ) иммунорадиометри- ческим методом. Цель изобретения получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus inusculus L., продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к АФП человека и животных. Ытамм получают гибридизацией клеток миеломы Х63..653 со сплено- цитами мышей ВАЕВ/с, иммунизирован- ньгх очищенным АФП человека, Штамм депонирован ВСКК (II) № 346.D. Штамм продуцирует МонАТ класса IftGI. Клетки культивируют в среде DMEM или RPMT 1640 с 15% сыворотки эмбриона коровы и стандартными добавками при 5% С02 в воздухе. Клетки перевивают in vivo через 3-4 дня с начальной плотностью ( 1-2) . Клетки рас-тут в организме сннгенцих мышей в виде асцитных опухолей. Титр МонАТ в асцитных жидкостях 10 при определении методом EITSA. S