1
(21)4674646/13
(22)21.02.89
(46) 28.02.91. Виол. № 8 (71)Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Научно-исследовательский институт лекарственных средств и Химико-фармацевтический комбинат Акрихин
(72)В.Н.Крылов, А.С.Яненко, Е.В.Фрейзон, В.З.Ахвердян, Б.И.Демченко, В.И.Тропика, Н.И.Кис- ленко, Н.В. Домрачев, А.НЛ; маков, Е.М.Вайсман, Г.И.Коновалова,
В.В.Козельский, Т.В.Червяк и Э.Ф.Ум- нова
(53) 576.8:577.17.02(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР R- 578334, кп. С 12 Р 33/00, 1976.
(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIUM MEDIOLANUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ СВОБОДНЫХ ИЛИ АЦИЛИРОВАННЫХ 3 $-ОКСИ &5-СТЕРОИЛОВ В 3-KETO-Af- СТ ЕРО ИДЫ
(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической трансформации стероидов. Цель изобретения - с тздание штамма, устойчивого к фагу РСМ. Птамм получен путем многоступенчатой селекции на устойчивость к бактериофаг-у РСМ из штамма-прототипа Corynebacterium mediolanum B-964 и депонирован под номером ВКШ N В-4657. Штамм хорошо растет на производственных средах, устойчив к бактериофагу РСМ в концентрации 10 ч/мл, активно трансформирует стероидный субстрат. Выход целевого продукта составляет 77-88,23% от внесенного стероида.
с
S
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ получения вещества рейхштейна и его производных | 1976 |
|
SU578334A1 |
| Способ получения 11-оксизамещенных прегенен-4-диол-17 ,21-диона-3,20 или его производных | 1975 |
|
SU511946A1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11 β -ГИДРОКСИСТЕРОИДОВ | 1989 |
|
SU1656870A1 |
| Способ получения стероида | 1978 |
|
SU896070A1 |
| Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы | 1990 |
|
SU1731814A1 |
| Способ получения гидрокортизона | 1986 |
|
SU1411336A1 |
| ШТАММ PIMELOBACTER SIMPLEX, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ СТЕРОИД-1,2-ДЕГИДРОГЕНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ | 2001 |
|
RU2215038C2 |
| Штамм гриба BeaUVeRIa ваSSIаNа (BaLS) VUILL для производства инсектицидного препарата боверина | 1989 |
|
SU1688820A1 |
| Штамм гриба BeaUVeRIa ваSSIаNа BaLS в качестве трансформатора для гидроксилирования 1-бензоилпиперидина и 1-бензоиламино-3,7-диметилоктадиена-2,6 | 1990 |
|
SU1822886A1 |
| Рекомбинантная плазмидная ДНК рRД 6 - источник зонда для тестирования представителей рода FRaNcISeLLa, штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рRД 6 - источник зонда для тестирования представителей рода FRaNcISeLLa | 1989 |
|
SU1669981A1 |
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической трансформации стероидов.
Цель изобретения - создание штамма, устойчивого к фагу РСМ.
Штамм Corynebacterium mediolanum СМ-А311 получен путем многоступенчатой селекции на устойчивость к фагу РСМ из штамма С.mediolanum B-964. Штамм СМ-А311 депонирован под номером ВКПМ № В-4657 и характеризуется следующими признаками.
Культурально-мор- фологические признаки.
Молодые клетки палочки размером 0,3-0,4x1,6-1,8 мкм, изредка соединенные концами. Старые клетки пред ставляют собой кокки размером 0,4- 0,5x0,5-0,65 мкмо Спор не образует, неподвижные.
Мясопептонный агар На 3-й сутки уоста при 30°С штамм образует круглые колонии диаметром 3-5 мм с ровными краями, форма выпуклая, конусообразная с выраженной вершиной, цвета слоновой кости при выдерживании в темноте и лимонно-желтого цвета на свету, пигмента в среду не выделяет, консистенция маслообразная, суспензия в воде равномерная.
Агаризованная среда СМ-6, Д-глюко- за 3 г, дрожжевой автолизат 6 г, К2НР04 1,8 г, Na HP04x 12 Н40 4 г,
Ф
00
00
NaCl 2 г, дистиллированная вода по
1 л, агар 15 г, рН 7,3-7,4, рост анЛотичен росту на МНа.
Агаризованная среда Хоттингера: рост штамма аналогичен росту на МПА.
Физиолого-биохим и ческие свойства.
Молодые клетки грамотрицательные, старые клетки грамположительные. Аэроб для оптимального роста требует интенсивной аэрации.
Рост культуры происходит в интервале температур от 20 до 37 С, в интервале рН от 5,5 до 9,5, Оптималь- ный рост культуры происходит при 33 С. Культура хорошо растет при рН 6,8-7,2, оптимум рН составляет 7,0.
Отношение к источникам азота: усваивает азот в форме мочевины, сульфата аммония, аргинина.
Отношение к источникам углерода; ассимилирует глюкозу, сахарозу, ксилозу, манозу, арабинозу,
Фагоустойчивость: в присутствии 10 частиц фага нормально развивается и осуществляет процесс трансформации.
Штамм хранят в лиосЬнлизированном состоянии в течение 1 г.
Использование штамма СМ-А311 иллюстрируется следукнцими примерами „
Пример 1. Использование штамма C.mediolanum CM-A311 для трансформации моноацетата вещества R в вещество S Рейхштейна в присут- ствии фага РСМ.
Трансформационную активность СМ-А311 оценивают в сравнении со штаммом-прототипом в одинаковых условиях. Для получения рабочих культур оба штамма, хранящихся в лиофильно-высушенном состоянии, вы- рашивают стерильно в течение двух пассажей по 30 ч при Т 33 С в пробирках на скошенных столбиках агари- зованной питательной среды PS (пептон 4,5 г, дрожжевой экстракт 3 г, гидролизат казеина 4 г, мясопептон- ный Ьульон 150 мл, глюкоза 1 г5 агар 0,20 г, вода до 1 л, рН 6,9-7,0). Затем осуществляют в стерильных условиях накопление посевного материала в конических колбах объемом 50,0 мл со 100 мл жидкой питательной среды СМ 6. Для этого рабочую культу ру с поверхности скошенных столбиков агаризованной среды PS смывают 5 мл физиологического раствора и по 055 м полученной суспензии засевают СМ-6
0
Q
Q
5
0 5
5
0
5
в двух колбах, в которых выра-цивают i генерацию культур в течение 24 ч при на круговой качалке с 220 об/мин..Полученную культуру в количестве 0,6% используют в качестве посевного материала для выращивания II генерации культур на среде СМ-6 в аналогичных условиях,
Полученную культуру в количестве 7,5% (объемных) используют для выра- гаивания трансформационной культуры в колбах объемом 500 мл со 100 мл питательной среды ВК-4К (кукурузный экстракт 8 r/jijNa HPO. x 12 HgO 4,65 г/л, 1 г/л, рН 7,1) при 33 С в течение 16 ч и параллельно в лабораторных ферментерах с 5 л питательной среды ВК-4К в присутствии индуктора, в качестве которого используют 0,1 г/л стероидного субстрата в тех же условиях. В колбы параллельно с культурой добавляют фаг РСМ в конечной концентрации 1,5x10 ч./мл (в качестве контроля в одну из колб со штаммом-про отипом фаг не добавляют) . Контроль за ростом культур осуществляют по изменению рН и оптической плотности культуральной жидкости (предварительно разведенной в 10 раз)„
Для проведения трансформации стероидный субстрат, предварительно размельченный до размеров частиц 5-15 мкм, вносят по 250 мг (5 г/л) в колбы и по 50 г (10 г/л) в ферментеры. В колбу со штаммом-прототипом, выращенным в присутствии фага РСМ, стероид не вносят, так как культура полностью лизирована с образованием фага в концентрации 10 ч./мл. Трансформацию проводят в тех же условиях, что и выращивание культур под контролем процесса трансформации.
Содержание целевого продукта в культуральной жидкости при использовании штамма CM-АЗ 11 в присутствии фага РСМ составляет 4,27 г/л (выход 85,4% от загруженного MAR), а при использовании штамма-прототипа в отсутствии фага - 4,23 г/л (84,6%), так как в присутствии фага штамм- прототип лизируется полностью.
Процесс трансформации заканчивается через 13 ч как у штамма СМ-А3.11, так и у „штамма-прототипа. Выход конечного продукта при использовании штамма СМ-А311 составляет 38,20 г вещества Рейхштейна (76,4% от загру-
51
женного субстрата), а при использовании штамма-прототипа - 38,05 г (76,1% от загруженного субстрата).
При использовании СМ-А311; удельный показатель поглощения при длине волны 241 нм составляет 458,5; т.пл. 211°С, потери в весе при высушивании 0,25%; хроматографическая чистота меньше 1% примесей (под УФ) и следовые количества (при опрыскивани хроматограмм серной кислотой).
При использовании штамма-прототипа В-954: Е °М467,7, т.пл. 209°С, потеря в весе при высушивании 0,35%, хроматографическая чистота 1% примесей (под УФ) и следовые количества (при опрыскивании хроматограмт. серной кислотой).
Пример 2. Использование штамма C.mediolanum CM-A311 для трансформации вещества R в вещество S Рейхштейна в присутствии фага РСМ.
Трансформационную активность штамма.СМ-A311 оценивают в сравнении со штаммом-прототипом. Выращивание культур и процесс трансформации.осуществляют так же, как описано в примере 1. В качестве субстрата используют вещество R Рейхштейна (5-прег- нен-3{3, 1706, 21-триол-20она). Загрузку вещества R производят в концентрации 4 г/л культуральной жидкости в
76
виде водной суспензии. Добавление фага РСМ производят в колбы до конечной концентрации 1 ,5x10 ч/мл аналогично тому, как описано в примере 1. Трансформация проходит полностью за 10 ч, как в случае штамма СМ-А311, так и в случае штамма-прототипа в отсутствии фага РСМ-15,5 г (77,2% от загруженного вещества R)f В случае выращивания штамма-прототипа в при- . сутствии фага РСМ наблюдается полный лизис культуры.
Таким образом, штамм-трансформатор СМ-АЗ 11 СВКПМ В-4657), сохраняя высокую трансформационную активность как по времени трансформации, так и по выходу целевого продукта, ус- тойчив к фагу РСМ, выделенному в производственных условиях, что позволяет сократить число фаголизисных операций, приводит к экономии сырья,, электроэнергии, трудозатрат. Использование штамма обеспечивает стабильность и рентабельность производственного процесса. Формула изобрете.ния
Штамм бактерий Corynebacterium mediolanum ВКПМ № Ь-4657. используемый для трансформации свободных или ацилированных ЗЙ-окси-Д -стеро- идов в 3-кето-А -стероиды.
