Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. продуцент моноклональных антител к инсулину Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано для индикации и аффинной очистки инсулина человека.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS musculus, продуцирующих моноклонапьнь1е антитела к инсулину., способные в одинаковой степени хорошо взаимодействовать как с инсулином свиньи, так и с инсулином человека.

Штамм получают следующим образом.

4-недельных линии BaLb/c иммунизируют монопиковым инсулином свиньи в течение 1 мес Зраза 30 мкгинсулина. При первой инъекции раствор инсулин а суспендируют в равном объеме адьюванта Фрейнда, последующие .. инъекции проводят без него. Титр антител- в сыворотке крови животных, опре- деляемый методом ELISA, составляет 1: : 15000. За 4 дня до слияния иммунизируют -раствором инсулина в физиологическом растворе. Через 4 дня у мыши извлекают селезенку в стерильных условиях, гомогенизируют в физиологическом растворе, содержащем 10%-ную глюкоау, и оставляют стоять 3 мин. Грубый осадок отбрасывают, а взвесь клеток переносят в центрифужный стасд

CD

сл

:о

:

кап и центрифугируют 8 мин при 800g, Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок суспендируют в 50 мл физиологического раствора, содержащего глюкозу, снова центрифугируют в тех же у сло- виях. Эту операцию повторяют 2 раза. Ан шогичным образом промывают Зраза 4и зи(Логическим раствором миеломные клетки ныши линии SP 2/0. После этого селезе- .HO iHbie клетки смешивают с миеломными в ..софтношении 10: 1 и осаждают их центри- фyгjиpoвaниeм. Надосадочную жидкость сливают и к осадку медленно по каплям . добавляют 1 мл 50%-ного полиэтиленгли- коЯя в физиологическом растворе, со- держащего 10% диметилсульфоксида. Через 3 мин медленно в течение 5 мин добавляют физраствор, содержащий глюкозу, до объема 50 мп, клетки осажда- ют центрифугированием и осадок суспен- 1дируют в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ДМЕМ), содержащей 10% фатальной сыворотки крупного рогатого скота; 3,5 мМ глютамина; 17,5 мкМ пи- 25 рувата натрия; 50 мкМ 2-меркаптоэта- нола; 100 мкМ гипрксантина; 16 мкМ тимидина и 0,4 мкМ аминоптерина. Клетки распределяют в пяти 96-луночных микропланшетах и культивируют в .инкубаторе при 37°С в .атмосфере 5% СОj..Через 5 дней клетки подкармливает. Через 2 нед после начала слияния проводят тестирование гибридом иа наличие монАТ методом ELISA. Клетки, .положительные по результатам тестиро-35 вания, помещают в среду, содержащую ;все указанные компоненты, за исключением аминоптерина (НГ-среда), Клетки наращивают в 24-луночных микропланцита мьшам ВаЬЪ/с за 7 дней до вве ния гибридомных клеток вводят .2, 6, 10, 14-тетрйметилпента-декан в/бр. На седьмой день штамм клеток инъецируют в/бр в количестве 500 т клеток намыль, Аецитную жидкость о бирают на 12-14-й день. Объем асци составляет 5-6 мл. Клетки из асцит перевивают мзшам в течение 8-10 па сажей без заметного изменения титр монАТ в асцитной жидкости.

Характеристика полезного продук

МонАТ относится к IgGl подкласс и имеет аффинную константу М

Кариологическая характеристика штамма. Модельное число хромосом 8 маркерные хромосомы не выявлены,

Продуктивность штамма. Концентр ция моноклональных антител в культ ральной жидкости на седьмой день к тивирования составляет 100 мкг/мл, в асцитной жидкости 10-12 мг/мл пр определении по методу Лоури и в EL

Криоконсервирование. Клетки шта ресуспендируют в смеси,.содержащей 10% ДМСО, 30% фетальной сыворотки 60% среды ДМЕМ, в концентрации 11 клеток на 1 мл, разливают при пластиковые ампулы, помещают в пал уретановые контейнеры и переносят холодильник на -70°С на 18 ч. Зате клетки переносят в жидкий азот на длительное хранение. Размораживани производится при в водяной ба Жизнеспособность клеток оцениваетс с помощью трипанового синего и сос ляет 40%,

Концентрация. Бактерии и грибы культуре не обнаружены при длитель

шетах и клонируют в полужидком агаре, наблюдении. Тест на микоплазму

цита мьшам ВаЬЪ/с за 7 дней до введения гибридомных клеток вводят мл .2, 6, 10, 14-тетрйметилпента-декана в/бр. На седьмой день штамм клеток инъецируют в/бр в количестве 500 тыс клеток намыль, Аецитную жидкость отбирают на 12-14-й день. Объем асцита составляет 5-6 мл. Клетки из асцита перевивают мзшам в течение 8-10 пассажей без заметного изменения титра монАТ в асцитной жидкости.

Характеристика полезного продукта

МонАТ относится к IgGl подклассу и имеет аффинную константу .

Кариологическая характеристика ,i штамма. Модельное число хромосом 80, маркерные хромосомы не выявлены,

Продуктивность штамма. Концентрация моноклональных антител в культу- ральной жидкости на седьмой день култивирования составляет 100 мкг/мл, а в асцитной жидкости 10-12 мг/мл при определении по методу Лоури и в ELIS

Криоконсервирование. Клетки штамм ресуспендируют в смеси,.содержащей 10% ДМСО, 30% фетальной сыворотки и 60% среды ДМЕМ, в концентрации 110 клеток на 1 мл, разливают при в пластиковые ампулы, помещают в пали- уретановые контейнеры и переносят в холодильник на -70°С на 18 ч. Затем клетки переносят в жидкий азот на длительное хранение. Размораживание производится при в водяной бане Жизнеспособность клеток оценивается с помощью трипанового синего и состаляет 40%,

Концентрация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длитель ном наблюдении. Тест на микоплазму

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для индикации и аффинной очистки инсулина человека. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, продуцирующих моноклональные антитела (мон АТ) к инсулину, способные в одинаковой степени хорошо взаимодействовать как с инсулином свиньи, так и с инсулином человека. Штамм получают гибридизацией клеток мышиной миеломы линии SP 2/0 с клетками селезенки мышей линии BALB /C, иммунизированных монопиковым инсулином свиньи. Штамм депонирован в ВСКК(II) N 257Д. Клетки культивируют в среде ДМЕМ, содержащей 10 % фетальной сыворотки, 3,5 мм глюматина, 17,5 мкМ пирувата натрия, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола

посевная доза 25000 клеток/мл, пассирование 1 раз в 5-6 дней. Штамм продуцирует специфичные к инсулину монАТ класса IGG 1 и имеет аффинную константу К 1х10 1° М -1. Гибридома стабильно продуцирует монАТ в течение 8-10 пассажей, и концентрация монАТ в асцитной жидкости составляет 12-13 мг/мл.

Клонирование гибрид ами повторяют 3 раза. Гибридому 5Н, 1В, 10Б перевивают на мышах ВаЬЪ/с для получения. асцт-- ной жидкости.дс

Штамм гибридомы, синтезирующий ио.н AT к инсулину, депонирован под номером ВСКК(П) № 257D и характеризуется .следующими признаками.

Культур ал ьнь:е свойства.

Дпя выращивания штамма используют культуральные флаконы. Во флакон объемом 25 мл в 3 мл среды ДМЕМ, содержащей 10% фетальной сыворотки, 3,5 мМ глютамина; 17,6 мкМ пирувата натрия, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, засевают . 250000 клеток гибридомы 5Н, ,18, 10В и про.водят пассажи 1 раз в 4-5 дней с подсчетом клеток. Для получения ас

отрицателен.

Пример, Моноклональ1ые антитела используют для определения концентрации инсулина методом иммунофермен- тного анализа. В 96-луночные полистироловые планшеты для М1 кротитрования помещают 100 мкл (10 мкг/мл) раствора моноклональных антител в О,1 М карбонатном буфер е (рН 9,0) и инкубируют в течение 2 ч. Затем в каждую лунку микропланшета помещают 0,1%-ный бычий сывороточный альбумин (БСА) в том же буфере и инкубируют 2 ч. Лунки микропланшета промывают 0,015 М фос- 55 фатным буфером (рН 7 ,4),, содержащим 0,15 М NaCl иО,05% твин-20 (ФБТ), К адсорбированным на полистироле MOHO-J клональным антителам добавляют 100 мкл

50

5159

раствора, содержащего исследуемой образец инсулина и инсулина с ковалентно пришитой к нему перокси- дазой в ФБТ, В контрольные лунки помещают такой же образец, но не содержащий инсулин. Инкубируют 1ч при . , Промывают ФВТ и добавляют в каждую лунку субстратную смесь: 0,03% 2 ьМ АВТ (2.2-азино-ди-этилбен- зотиозолин-(6)-сульфоновой кислоты; 0,05 М цитратный буфер, рН 4,0. Оптическую плотность считывают при 412 нм на автоматическом считывающем устройстве. .Концентрацию инсулина вычисляют по построенной в параллельном эксперименте калибровочной кривой, полученной в аналогичных условиях, однако в лунки микролланшета помещают извест- концентрации инсулина,

Чувствительность определения инсулина этим методом составляет 100 пкг гормона7ма,

Специфичность взаимодействия моно- клональных антител с инсулином оцени- вают методом .конкурентного .иммунофер- ментного анализа в следующей системе: моноклональным антителам, адсорбиро- ваниым на полистироле, добавляют инсулин свиньи, меченый пероксидазой, а также немеченый инсулин свиньи, быка, человека или же изолированные А- и В- Цепи инсулина. Степень взаимодействия

мойоклональных антител с инсулинами из других источников, а также А- и В- цепями оценивают по проценту ингиби- рования связывания кон1ьюгата инсулин- пероксидаза по сравнению со связыванием в присутствии инсулина свиньи в качестве конкурирующего агента.

Моноклональные антитела 5Н, 1В, 10В одинаково взаимодействуют с инсулином человека и свиньи, однако для ингибирования связывания конЬюгата инсулин свиньи-пероксидаза на 50% требуются в 10 раз более высокие кон- центрации инсулина быка, чем немече ноге инсулина свиньи. Таким образом, монокпональные антитепа к инсулину свиньи могут быть использованы для количественного определения инсулина человека. Они оказываются пpигoднь м также для аффинной очистки генно-инженерного инсулина человека. На колой ке на основе BrCN активированной ага- розы, с которой связано 6-10 М моно- клональных антител, можно получить более чем инсулина.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. . BCKK(II) № 256D - продуцент монокло- нальных антител к инсулину..