Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в иммунологических методах исследования для определения формиатдегидрогеназы.
Штамм получают следующим образом.
Для иммунизации используют бактериальную формиатдегидрогеназу. Четырехнедельных мышей линии Baeb/с иммунизируют в течение месяца 3 раза 50 мкг антигена. При первой инъекции раствор антигена суспендируют в равном объеме адъюванта Фрейнда; последующие инъекции проводят без него. Титр антител в сыворотке крови животных, определяемый методом ELISA, составляет 1:20 000. За 4 дня до слияния мышей иммунизируют раствором антигена в физиологическом растворе. Через 4 дня у мыши извлекают селезенку в стерильных условиях, гомогенизируют в физиологическом растворе, содержащем 10% глюкозы, и оставляют на 3 мин. Грубый осадок отбрасывают, а взвесь клеток переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 8 мин при 800g. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок суспендируют в 50 мл физиологического раствора, содержащего глюкозу. Затем снова центрифугируют в тех же условия. Эту операцию повторяют 3 раза. Аналогичным образом промывают 3 раза физиологическим раствором миеломные клетки мыши линии Sp 2/0.
После этого селезеночные клетки смешивают с миеломными в соответствии 10: 1 и осаждают их центрифугированием. Надосадочную жидкость сливают и к осадку медленно по каплям добавляют 1 мл 50%-ного полиэтиленгликоля в физиологическом растворе, содержащем 10% диметилсульфоксида. Через 3 мин медленно в течение 5 мин добавляют физиологический раствор, содержащий глюкозу, до объема 50 мл. Клетки осаждают центрифугированием и осадок суспендируют в среде Игла, модифицированной Дульбенко (DMEM), содержащей 10% сыворотки крови оленей, 3,5 мм глутамина, 17,5 мкм цирувата натрия, 50 мкм 2-меркаптоэтанола, 100 мкм гипоксантина, 16 мкм тимидина, 0,4 мкм аминоптерина. Клетки распределяют в пяти 96-луночных микропланшетах и культивируют в СО2-инкубаторе при 37о С в атмосфере 5% СО2. Через 5 дней клетки подкармливают, убирая из каждой лунки 50 мкл среды и добавляя 50 мкл свежей.
Через 2 недели после слияния проводят тестирование гибридом на наличие моноклональных антител методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, используя для сорбции на полистироловых микропланшетах высокоочищенную формиатдегидрогеназу.
В лунки 96-луночных панелей для микротитрования помещают по 100 мкл высокоочищенной формиатдегидрогеназы (10 мкг/мл), растворенной в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,0. Инкубируют в течение 2 ч при 37о С и отмывают 0,01 М Na-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl (ФБР). Оставшиеся центры связывания на полистироле блокируют бычьим сывороточным альбумином (10 мг/мл), растворенным в карбонатном буфере, который использовался для сорбции антигена. Инкубируют 2 ч при 37о С и отмывают 4 раза 200 мкл ФБР, содержащего 0,05% Твина 20 (ФБРТ). Затем в лунки для микротитрования помещают образцы, тестируемые на наличие моноклональных антител [культуральную жидкость из микропланшетов и флаконов в объеме 50 мл или асцитные жидкости, разведенные 1: 50 в ФБРТ, содержащем 5 мг/мл БСА (ФБРТ-БСА)], которые раститровывают 1:2 в том же буфере в 16 лунках микропанелей. В качестве контроля используют асцитные жидкости и моноклональные антитела к неродственным антигенам из других источников. Образцы инкубируют 1 ч при 37о С, а затем отмывают ФБРТ, как описано выше. В лунки панелей для микротитрования добавляют 0,1 мл субстратной смеси, содержащей 0,03% Н2О2, 2 мм АБТС (2,2 - азино-бис-3-этилбензоилтиозолин-(6)-сульфоновая кислота), 0,05 М цитратного буфера, рН 4,0. Оптическую плотность считывают при 212 нм через 20 мин на автоматическом устройстве.
Клетки, положительные по результатам тестирования, помещают в среду, содержащую все указанные выше компоненты, за исключением аминоптерина (НТ-среда). Клетки наращивают в 24-луночных микропланшетах, часть из них замораживают, а остальные клонируют в полужидком ангаре. Для этого приготавливают 5 и 3% растворы агара на 0,9% растворе NaCl, который автоклавируют при 1 атм 15 мин. Расплавленный при 100о С в сосуде с кипящей водой агар помещают в водяную баню на 44о С. Разбавляют 5% агар ростовой средой, не содержащей гипоксантина, аминоптерина и тимидина, до концентрации 0,5%, тщательно перемешивают и по 3 мл помещают в пластиковые чашки Петри (диаметр чашек 2,5 см). Дают агару застыть.
Расплавленный 3% агар разводят в 10 раз ростовой средой, содержащей 100 тыс./мл перитонеальных макрофагов, тщательно перемешивают, помещают в водяную баню на 44о С. В агар добавляют 100 мкл среды, содержащей 1х105 клеток гибридомы, тщательно перемешивают и 1 мл смеси распределяют тонким слоем по поверхности 0,5% агара. Чашки переносят в СО2-инкубатор в атмосферу 5% СО2 и оставляют на 10 дней. На 10-12-й день автоматической микропипеткой отбирают под микроскопом колонии и переносят их в 96-луночные панели для микротитрования, лунки которых заполнены ростовой средой. После образования монослоя тестируют супернатанты на содержание моноклональных антител методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Положительные по результатам тестирования гибридомы реклонируют дважды, наращивают и замораживают. Клонированную гибридому перевивают на мышах с целью получения асцитной жидкости.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Культуральные свойства. Для выращивания штамма используют культуральные флаконы. Во флакон объемом 25 мл в 3 мл среды, содержащей 10% фетальной сыворотки, 3,5 м глутамина, 17,5 мкм пирувата натрия, засевают 250000 клеток гибридомы и проводят пассажи 1 раз в 4-5 дней с подсчетом клеток. Клетки выращивают при 37о С в атмосфере 5% СО2, время удвоения популяции 24 ч. Для получения асцита мышам Baeb (с за 7 дней до введения гибридомных клеток вводят 0,5 мл 2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекана в/б). На 7-й день штамм клеток инъецируют в/б в количестве 1-42 млн. клеток на мышь. Асцитную жидкость отбирают на 10-й день. Объем асцита составляет 4-5 мл. Клетки из асцита перевивают новым мышам в течение 5 пассажей без заметного изменения титра моноклональных антител в асцитной жидкости.
Кардиологические признаки. Модальное число хромосом 98. Маркерных хромосом не выявлено.
Продуктивность штамма. Концентрация моноклональных антител в культуральной жидкости на 7-й день культивирования составляет 130 мкг/мл, а в асцитной жидкости 7 мг/мл при определении методом твердофазного иммуноферментного анализа.
Характеристика полезного продукта, Моноклональные антитела относятся к подклассу IgG2а.
Константа афинности составляет 4.108 М-1. Антитела специфичны к формиатдегидрогеназе Pseudomonds sp. 101, однако перекрестно реагируют с ферментом из дрожжей Candida methylica, правда в 5 раз с меньшим сродством. Специфичность антител оценивают методом твердофазного иммуноферментного анализа. Минимальная концентрация формиатлегидрогеназы, определяемая с помощью полученных антител, составляет 5.10-11 М.
Контаминация. Бактерии, грибы и вирусы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.
Онкогенность. Онкогенные свойства не выявлены.
Криоконсервирование. Клетки штамма (500 тыс./мл) ресуспендируют в смеси, содержащей 30% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% диметилсульфоксида, 60% ДМЕМ, при 4о С, затем разливают в пластиковые ампулы и помещают в контейнеры из полиуретана. Контейнеры переносят в холодильник на -70о С на 24 ч. Затем клетки переносят в жидкий азот на длительное хранение. Размораживание производят в водяной бане при 37о С. Жизнеспособность клеток составляет 90%.
Использование штамма иллюстрируется следующим примером.
Для определения формиатдегидрогеназы используют твердофазный конкурентный иммуноферментный анализ.
Суть методом состоит в конкуренции между иммобилизованным на полистироле антигеном и антигеном в растворе за связывание с моноклональными антителами. Для получения количественных результатов такую систему калибруют разведениями антигена с точно известной концентрацией.
Сорбцию формиатдегидрогеназы в лунках полистироловых 96-луночных планшетов для микротитрования осуществляют в тех же условиях, что и при постановке твердофазного непрямого иммуноферментного анализа.
Построение калибровочной кривой осуществляют в 2 этапа.
1. Методом непрямого твердофазного анализа по методике, описанной выше, определяют рабочее разведение моноклональных антител, при котором не наблюдается их избытка по отношению к иммобилизованному антигену. Т.е. находят разведение моноклональных антител, при котором они связываются с иммобилизованным антигеном менее, чем на 100% от максимально возможного. Удобно использовать разведения моноклональных антител, при которых связывание антител с антигеном проходит на 60-70% от максимально возможного. Это разведение моноклональных антител оставляют фиксированным при построении калибровочной кривой по стандарту.
2. Высокоочищенную формиатдегидрогеназу, используемую в качестве стандарта, растворяют в ФБРТ-БСА и помещают в варьируемых концентрациях в лунки полистироловых микропланшетов (1х10-9 - 1х10-13 М) в объеме 50 мкл. Во все лунки добавляют 50 мкл моноклональных антител, растворенных в ФБВТ-БСА в рабочем разведении, определяемом как описано в п.1.
В качестве контроля проводят раститровку формиатдегидрогеназы в тех же условиях, но в присутствии адсорбированного на полистироле бычьего сывороточного альбумина.
В параллельном эксперименте в лунки того же микропланшета помещают образцы, исследуемые на содержание формиатдегидрогеназы. Содержимое лунок тщательно перемешивают и инкубируют 1 ч при 37о С. Отмывают 3 раза ФБРТ и далее инкубируют с 50 мкл кроличьего антимышиного конъюгата, меченного пероксидазой, растворенного в ФБРТ-БСА. Инкубируют в течение 1 ч при 37о С. После этого повторяют процедуру отмывания и лунки заполняют субстратной смесью как описано выше. Через 30 мин считывают оптическую плотность при 412 нм. Концентрацию формиатдегидрогеназы в испытываемых образцах определяют по калибровочной кривой зависимости оптической плотности от концентрации фермента, полученной в этом же эксперименте. Минимальная концентрация формиатдегидрогеназы составляет 5.10-11 М.
Использование: биотехнология, экспериментальная энзимология. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus musculus L, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к формиатдегидрогеназе Pseudomonas sp 101. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/с с клетками миеломы мыши sp2/0. МКА относятся к подклассу IgG 2а. Константа аффинности составляет 4·108M-1 . Минимальная концентрация формиатдегидрогеназы, определяемая с помощью полученных антител, составляет 5·10-11M .
Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. ВСКК (II) N 570Д, используемый для получения моноклональных антител к формиатдегидрогеназе Pseudomonas sp. 101.
