Способ выделения цитохрома С из дрожжей Советский патент 1990 года по МПК A61K38/44 A23J1/18 A61K35/72 C12N9/02 

ношении 1-1,5. Супернатанты объединяют и фракционируют путем ультрафильтрации в установке Пеликон фирмы Миллипор последовательно на мембранах 100000, 30000 и 1000 дальтон.Концентрат фракции белков, обогащенной цитохромом С, собирают на мембране 1000 дальтон, промывают водой и затем хроматографируют в одну стадию на ионообменной колонке размером |30х200 мм, наполненной котионитом IRC-590 уравновешенным 0,15 М аммо- нийно-фосфатным буфером (рН 7,0), концентрируют на мембране ИМ-10 Ami- con, подвергают гель-фильтрации на колонке размером 16x400 мм с се- фадексом Y-50 и лиофшшзируют. Чистота препарата по белку 99%.Время, затраченное на выделение 100 мг цитохрома С из биомассы дрожжей,составило 20 ч.

Пример20 Дрожжи Candida uti- lis штамм ВСБ-726 выращивают, по примеру 1. Клетки дрожжей дезинтегрируют в 10%-ном растворе поваренной соли в баллистическом дезинтеграторе ФУГ-1 в течение 1 ч при 2500 об/мин с добавлением абразива в количестве 150 мл насыпного об.ъема. Обработку дезият.еграта и дальнейшую очистку цитохрома С проводят по примеру 1. В качестве ионообменника применяют смолу БИОКАРБ Д. После гель-фильтрации и лиофильной сушки получают электрофоретическй чистый препарат.

Пример 3. Для выделения цитохрома С используют биомассу дрож

0

5

0

5

жей Candida krusei штамм ВСБ-896.Дрожжи дезинтегрируют в 15%-ном растворе поваренной соли в аппарате ФУГ-1 при условиях дезинтеграции, описанных.в примере 2 о Ультрафильтрацию проводят по примеру 1. Катионит IRC-50 уравновешивают 0,1 М аммонийно-фосфатным буфером с рН 7,0, а цитохром С элюи- руют с колонки 0,35 М аммонийно-фосфатным буфером с рН 7,0. Дальнейшую очистку цитохрома С проводят по примеру 1. Чистота полученного препарата выше 99% по белку (определенная спектральным методом, подтверждена методом гель-фильтрации высокоэффективной жидкостной хроматографии).

Как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет получить препарат высокой чистоты.

Формула изобретения

Способ выделения цитохрома С из дрожжей, включающий внесение солевого раствора, дезинтеграцию клеток с экстракцией, фракционирование экстракта, ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, лиофильную сушку, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты препарата и сокращения сроков выделения, в качестве солевого раствора используют 7-15%-ный раствор хлорида натрия, а фрикционирования осуществляют последовательно на ультрафильтрационных мембранах 100000, 30000, 1000 даль- тон.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическим способам получения цитохрома С. Цель изобретения - повышение частоты препарата и упрощение процесса выделения. Дрожжи выращивают в периодическом процессе на минеральной среде, содержащей соли: фосфорнокислый калий, сернокислый аммоний, сернокислый магний, хлористый натрий, сернокислое железо, дрожжевой автолит 32, и вкачестве источника углерода - этиловый спирт. Клетки дрожжей подвергают механической дезинтеграции при обработке 7-15%-ным раствором поваренной соли. Полученный дезинтеграт фракционируют путем ультрафильтрации последовательно на мембранах 100000, 30000 и 1000. Полученный на мембране 1000 концентрат белковой фракции, содержащей цитехром С, хроматографируют на катионном ионообменнике в аммонийно-фосфатном буфере PH 7,0. Затем раствор цитохрома С концентрируют, подвергают гель-фильтрации и лиофильно высушивают. Получают препарат с чистотой 99%.

Редактор М.Петрова

Составитель Д.Папковский Техред Л.Сердюкова

Заказ 1114

Тираж 565

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Корректор О.Ципле

Подписное