Способ выделения цитохрома @ из дрожжей Советский патент 1983 года по МПК C12N9/00 

00

SI

|

о

00

4 Изобретение относится к микробио логической промьшшенности, а именно к способам вьщеления цитохрома С из дрожжей. Цитохром С может использоваться в качестве биохимического реактива а также как стимулятор Дыхания и ок лительного фосфорилирования в бесклеточных системах. Кроме того, пре парат может быть весьма перспективным для применения его в клинической практике. Известен способ выделения цитохрома С из дрожжей, предусматриван)щий дезинтеграцию клеток, ионообменную хроматограф ira № №чбокислот ных карбоксильных катионЦ- в три стадий и лиофнльное вьгоушивание пре парата Cl J. Согласно этому способу клетки дрожжей разрушают этилацетатом и вьщерживают в течение 1 ч при 10 . Затем полученную суспензию фильтруют, осадок подвергают экстра ции (TSE)so (50% ОТ степени насы цени; . Экстракцию проводят 48 ч при.10-15 С. Белковый осадок Отделяют, а фильтрат диалйзуют в течение 36 ч. Затем для получен1|я цитохрома С фильтрат пропускают через колонку с ионообменной смолой. Элюа подвергают диализу и повторной хроматографии с поеледукхцим диализом. Полученную фракцию, содержащую цито С, концентрируют ..на колонке с ионообменной смолой, ЭЛЮЦЙЮПЕЮёодят воДньм раствором аммиака и ко центрированный расфвор цитохрома С подвергают лиофильной сушке. Недостатке известного способа является наличие трудоемких и длительных стадий , а именно: экстракци сульфатом аммония, отделения осадк многократного диайиза. Кроме того, этилацетат - легковЬспламенякадееся токсичное вещество, что затрудняет его применение в больишх количествах. Цель изобретения - упрощение процесса. /Указанная цель достигается тем, что в способе выделения цитохрома С из дрожжей, предусматривающем дезин теграцию клеток, ионообменную хроматографию на слабокислотных карбоксильных катионитах в три стадии и лйофильиое высушивание препарата, проводят механическую дезинтеграцию клеток при на первой стадии хроматографируют деэинтеграт, перед второй и третьей стадией элюат разбавляют водйй, а перед лиофильным высушиванием раствор подвергают гельфильтрации. Способ осуществляют следующим образом. Суспензию дрожжевых клеток подвергают механической дезинтеграцйй вдезинтеграторе ФУГ-1 или экст рузионном дезинтеграторе ДКМ-3 при температуре 0-8°С. Полученный дезинтеграт пропускают через колонку с ионообменной смолой, белок элюируют со смолы буфером, элюат разводят водой и хроматографию повторяют, затем еще р,аз разбавляют водой, и хроматографируют. Полученный раствор подвергают гельфильтрации, для которой xioryT быть использованы носители на основе декстрана или полиакриламида. Разбавление элюатов перед ионообменной хроматографией проводят для снижения ионной силы раствора; чтобы облегчить последующее связывание белка со смолой, а гельфильтрацию для обессоливания раствора. После гельфильтрации раствор лиофильно высушивают. В результате получают препарат, содёрясание цитохрома С в котором 95%. П р и мер 1. К 1 кг сырой биом ссы дрожжей сaadida valida ИБФМ-Y- -622 дОбавлйют 1л дистиллированной воды размшиваю.т мешалкой до получения гомогенной клеточной суспензии, котирую подвергают дезинтеграции в баллийтнческо дезинтеграторе ФУГ-1. Режим дезинтеграции: непрерывная дезинтеграция в течение 1 мин, объем дезинтегращионной камеры 200 мл, скорость вращения ротора ЗООО об/мин; абразив - дивинилбенэолстирольные, микрошарики (диаметром 250-300 мкм} в количестве 150 мл MacunHoiro объела; температуре в дезинтеграционной камере 4 С. Полученный Дезинтеграт пропускают через колонку (размером 22 «150 мм), заполненную катионитомКРК-1-5п. Препарат катионита используют в 1Н)- форме, уравновешенной 0,125 М агФюнийнофосфатным буфером рН 7; скорость пропускания дезинтеграта поддерживают на уровне 10 мл/мин« После прохождения дезинтеграта через колонку последнюю промывают 2 л Днетиллироэаннбй воды, затем проводят элюцию 0,25 М аммонийнофосфатным буфером рН 7. Полученный элюат разбавляют в 3 раза дистиллированной водой и такой раствор пропускают через Hosya колонку с катионитом КрК-1-5п. Описанный процесс ионо« об1(юнной хроматографии повторяют. Полученный элюат- подвергают гельфильтрации на колонке1100х1000 мл) заполненной обводненным niienaатом гранул акрилекса П-4, после его белковую фракцию/ содержащую цитохром С, подверггиот лиофильному высувшванию. Выход препарата цитохрома С составляет 280 мг на 1 кг сырой биоассы.

Чистота препарата nq данным спектрофотометрии и диск-электрофоре за в полиакриламидном tens составляет 95%.

П .р и м ер 2. Способ осуществляют по примеру 1, но ионообменную хроматох рафию проводят при 8°С, используя в качестве носителя гранулированный пористый слабокислотный карбоксильный катионит Дмберлит IRC-50; в качестве гельфильтрующёго Материсша используют бефадекс G-2$.

Вызсод препарата цитохрсша С 271на 1 кг сырой биомассы.

Пример 3. К 1 кг сырой биок ассы дрожжей Candida valida MB m-Y622 добавляют 1 л дистиллированной воды, размешивают мешгщкой до получения г(могенной клеточной взвеси и такую взвесь подвергают механической дезинтеграции в экструзионном дезинтеграторе ДКМ-3.

Параметры дезинтеграции: непреравкая дезинтегргщия; производительность - 1 л в-час, давление в |дезинтегра1и1онной камере - 3200 кг/см , температура в дезинтеграционной камере 0-8°С.

Далее способ осуществляют, как описано в примере 1. Выход цитохрома С составляет 255 мг на 1 кг сырой бисшассы. Чистота препарата по данньм спектрофотсялетрии и диск-электрофореза в полигис рилами дном геле составляет 95%.

ОписанньШ способ выделения цитоxiX}Ma С из дрожжей позвсшяет упростить процесс выделения и сократить . время его проведения более, чем в три раза. При этом получают препарат цитохром С с большим выходом и высокой степенью чистоты.

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМА .С ИЗ ДРОЖЖБЯ, предусматривающий дез.йнтеррацшо клеагсв( ионообмёнсгую хроматографию на слабокислотных карбог |ксильных катионитахв три стадии и :лиофильное высушивание препарат й, ;О т л и ч а ю tq и и с я тем, что, JC целью упрощения процесса, проводят ;механическую дезинтеграцию клеток при температуре 0-8с, на первой : стадии хроматографир т дезинтеграт, перед второй и третьей стадией элюат разбавляют водой, а перед лиофильным высушиванием полученньш раствор подвергают гельфацьтрации. .