СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМА C ИЗ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ Советский патент 1996 года по МПК C12N9/02 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам хроматографической очистки цитохрома C, получаемого путем микробиологического синтеза.

Известен способ хроматографической очистки цитохрома С, включающий механическую дезинтеграцию дрожжевых клеток, пропускание дезинтеграта через колонку с ионообменной смолой КРК-1-5п, элюцию цитохрома С со смолы буфером, повторную хроматографию на колонке с ионообменной смолой разведенного элюата и третью стадию ионообменой хроматографии, при этом в результате последующей гельфильтрации и лиофильного высушивания получают препарат 90-95%-ной чистоты, что позволяет его использовать как химический реактив невысокого класса.

Наиболее близким к изобретению является способ выделения и хроматографической очистки цитохрома С из биомассы дрожжей на ионообменной смоле Амберлит IRC-50 или смоле Биокарб Д, согласно которому дезинтеграт клеток дрожжей освобождают от клеточных стенок центрифуги- рованием и фракционируют путем ультрафильтрации последовательно на мембранах 100000, 30000 и 1000 дальтон, выделяя фракцию белков, обогащенную цитохромом С. Полученный на мембране 1000 дальтон концентрат белковой фракции, содержащей цитохром С, хроматографируют на катионите Амберлит IRC-50, извлекая из смеси белков цитохром С, который затем доочищают гельфильтрацией.

При разделении белков и пептидов на смоле Амбердит IRC-50 достигается высокая специфичность разделения. Однако скорость протекания растворов через колонку с таким сорбентом невелика 1-1,5 мл/см² в 1 мин, что удлиняет процесс очистки.

Кроме того, выход целевого продукта недостаточно высок из-за потерь вещества цитохрома С при хроматографической очистке на Амберлите IRC-50 (10-12% ).

Целью изобретения является ускорение процесса и повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в способе хроматографической очистки цитохрома С из биомассы дрожжей, включающем дезинтеграцию дрожжей, фракционирование путем ступенчатой ультрафильтрации, пропускание через слой сорбента раствора, содержащего цитохром С, и десорбцию цитохрома С буферным раствором, согласно изобретению, в раствор белка перед хроматографической очисткой добавляют феррицианид калия в количестве 1-1,5 мг на 100 мг хитохрома С, а в качестве сорбента применяют катионит КБ-2Т.

Применение ионообменой смолы КБ-2Т в качестве сорбента в данном способе позволяет ускорить процесс хроматографической очистки за счет повышения скорости сорбции и десорбции и повысить выход вещества за счет полноты десорбции.

Потери вещества при хроматографии на КБ-2Т составляют менее 1%
Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Клетки дрожжей, выращенных на минеральной среде с эталоном в качестве источника углерода, подвергают механической дезинтеграции при обработке раствором поваренной соли. Дезинтеграт освобождают центрифугированием от остатков клеточных стенок и фракционируют путем ступенчатой ультрафильтрации на мембранах 100000, 30000 и 1000 дальтон. Полученный на мембране 1000 дальтон белковый концентрат, содержащий цитохром С, подвергают хроматографической очистке.

Хроматографические колонки заполняют сорбентом КБ-2Т, через слой сорбента пропускают белковый раствор, содержащий цитохром С, в который добавляют феррицианид калия в количестве 1-1,5 мг на 100 мг цитохрома С, со скоростью 5-12 мл/см² в 1 мин, что сокращает время сорбции по сравнению с применением Амберлита IRC-50 в 5-8 раз. Сорбированный цитохром С элюируют буферным раствором рН 6,8-7,3.

При добавлении окислителя менее 1 мг на 100 мг цитохрома С наблюдается неполная сорбция на ионообменнике, а добавление более 1,5 мг экономически нецелесообразно (см. табл. ) и ведет к нежелательной сорбции сопутствующих белков.

Таким образом, добавление окислителя в белковый раствор, содержащий цитохром С, перед хроматографической очисткой позволяет снизить потери на стадии сорбции цитохрома С, а применение ионообменой смолы КБ-2Т в качестве сорбента в данном способе позволяет ускорить процесс хроматографической очистки за счет повышения скорости сорбции и снизить потери за счет повышения степени десорбции цитохрома С.

П р и м е р 1. Дрожжи Pichia membranafaciens штамм ВКМ У-934 выращивают на минеральной среде следующего состава: калий фосфорнокислый 3 г/л; аммоний сернокислый 1 г/л; магний сернокислый 1 г/л; натрий хлористый 0,2 г/л; сернокислое железо 0,06 г/л; дрожжевой автолизат 0,5 г/л; этанол (3%) в качестве источника углерода.

Клетки дрожжей подвергают механической дезинтеграции при обработке 7-15% -ным раствором поваренной соли. Полученный дезинтеграт фракционируют путем последовательной ультрафильтрации на мембранах 100000, 30000 и 1000 дальтон.

Ионообменную смолу КБ-2Т в количестве 10 г (по влажной массе) подготавливают к работе по ГОСТ и помещают в колонку размером 1,2х12 см. Смолу уравновешивают аммонийно-фосфатным буфером рН 6,8-7,3.

В полученный на мембране 1000 дальтон белковый раствор объемом 100 мл, содержащий 100 мг цитохрома С, вводят феррицианид калия в количестве 1 мг и пропускают раствор через слой ионообменника со скоростью 10-12 мл/см² в 1 мин, извлекая из смеси белков цитохром С. Затем цитохром С элюируют с колонки 0,25-0,35 М аммонийно-фосфатным буфером рН 6,8-7,3 со скоростью 0,05 мл/см² в 1 мин.

Чистота препарата, определенная спектральным методом, составляет 80% Такая степень чистоты позволяет получить препарат 99%-ной чистоты при последующей гельфильтрации.

В способе, осуществляемом по прототипу, скорость пропускания раствора через сорбент 1-1,5 мл/см² в 1 мин, потери вещества при хроматографической очистке 10-12%
В предлагаемом способе скорость пропускания раствора через сорбент 10-12 мл/см² в 1 мин, потери вещества менее 1%
П р и м е р 2. Дрожжи Candida utilis штамм ВСБ-726 выращивают и выделяют белковый раствор, содержащий цитохром С, как описано в примере 1. Смолу КБ-2Т в количестве 30 г (по влажной массе) подготавливают к анализу по примеру 1 и помещают в колонку размером 3х7 см, заполняя ее на высоту 5 см катионитом, уравновешенным буфером. В белковый раствор, содержащий цитохром С в количестве 500 мг в 500 мл, вводят 1,2 мг феррицианида калия на 100 мг цитохрома С, пропускают через колонку со скоростью 10-12 мл/см² в 1 мин. Полнота извлечения цитохрома С из белкового раствора 100% Цитохром С элюируют с колонки по примеру 1 со скоростью 0,10-0,12 мл/см² в 1 мин. Чистота препарата 80-82% Потери вещества не превышают 1%
П р и м е р 3. Дрожжи Candida hrusli штамм 896 выращивают и выделяют белковый раствор, содержащий цитохром С по примеру 1.

Смолу КБ-2Т в количестве 50 г (по влажной массе) подготавливают к анализу по примеру 1 и помещают в колонку размером 3х20 см, заполняют ее на высоту 15 см.

В белковый раствор, содержащий 1000 мг цитохрома С, вводят 1,5 мг окислителя феррицианида калия на 100 мг цитохрома С и пропускают через колонку с сорбентом. Извлечение цитохрома С и десорбцию проводят как описано в примерах 1 и 2. Скорость сорбции 10-12 мл/см² в 1 мин. Чистота препарата (80-82%) обеспечивает после гельфильтрации получение препарата 99%-ной чистоты. Потери вещества не превышают 1%
В белковый раствор, содержащий цитохром С вводят окислитель феррицианид калия и хроматографируют его на катионообменной смоле КБ-2Т, при этом происходит полное извлечение из смеси белков и сорбция цитохрома С, обусловленные применением в качестве сорбента катионита КБ-2Т. Указанная смола позволяет увеличить скорость пропускания белкового раствора на стадии сорбции в 10 раз по сравнению со смолой Амберлит IRC-50.

Таким образом, хроматографическая очистка цитохрома С с добавлением окислителя феррицианида калия на карбоксильном катионите КБ-2Т позволяет повысить скорость процесса на стадии сорбции в 10 раз, повысить выход вещества за счет снижения потерь на стадиях сорбции и десорбции до 20% исключить применение импортной ионообменной смолы Амберлит IRC-50 и снизить расходы на смолу в 5 раз.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам выделения цитохрома С, который может быть использован как биохимический реактив и как медицинский препарат при лечении ряда потологий, связанных с кислородной недостаточностью. Цель изобретения - ускорение процесса и повышение выхода целевого продукта. В предлагаемом способе хроматографической очистки цитохрома С в белковый раствор, содержащий цитохром С, перед хроматографической очисткой добавляют окислитель - феррицианид калия в количестве 1-1,5 мг на 100 мг цитохрома С и в качестве сорбента используют карбоксильный катионит КБ-2Т. В результате получают препарат 99%-ной чистоты. 1 табл.

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМА C ИЗ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ, включающий ее дезинтеграцию, фракционирование путем ступенчатой ультрафильтрации, пропускание через слой сорбента белкового раствора, содержащего цитохром С, и десорбцию цитохрома С буферным раствором, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса и повышения выхода целевого продукта, в раствор белка перед пропусканием добавляют феррицианид калия в количестве 1 - 1,5 мг на 100 мг цитохрома С, а в качестве сорбента используют катионит КБ-2Т.