Способ получения цитохрома С из дрожжей вида CaNDIDa VaLIDa Советский патент 1991 года по МПК C12N9/00 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в сельском хозяйстве и медицине.

Цель изобретения - упрощение и ускорение способа.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример1.К 2,5 кг сырой биомассы Candida valida, что соответствует 0,6 кг сухой биомассы, добавляют 4,25 л.1 М раствора хлорида натрия и подвергают дезинтеграции в баллистической мельнице при температуре 4-8°С. Полученный дезин- теграт центрифугируют при 3000 об/мин, осадок промывают 2 л 1 М раствора хлорида натрия. Супернатант фракционируют путем ультрафильтрации на мембранах Millipore

100000, 300000 и 1000 дальтон, после чего фракцию, обогащенную цитохромом С, концентрируют на мембране 1000 дальтон. Полученный раствор имеет объем 200 мл и концентрацию 2,9-3,5 мг/мл. Его подкисляют до рН 4,0-4,2, выдерживают 20 мин при 4°С и отделяют выпавшие негемовые белки центрифугирования при 500 об/мин. К су- пернатанту добавляют 20 мл раствора, содержащего 0,25-0,30 М сульфата кадмия и 0,5-0,6 М иодида натрия. Через 20 мин осадок отделяют центрифугированием при 5000 об/мин, промывают 0,2 М раствором иодида натрия, затем водой. Осадок растворяют в 10 мл 1 %-ного раствора гидроксида аммония, разбавляют 20 мл дистиллированной воды и наносят на ионообменную коо о со о

N5 N

лонку с катионитом К-6 в Н+ форме, рН 8,0-8,5. Колонку промывают дистиллированной водой, цитохром С смывают 0,5 М раствором гидроксида аммония, затем лио- филизуют. Выход составляет 380 мг. Соотношение поглощения при длинах волн (550 окисл.) - (280 восст,) лежит в пределах 1,28- 1,29. Чистота, определенная спектральным методом, по содержанию железа и электро- форетически, составляет 99%.

П р и м е р 2. 2,5 кг сырой биомассы Candida valida ВСБ-934 обрабатывают, как в примере 1, используя для экстракции 0,9 М хлорид натрия до процесса осаждения кадмиевого комплекса цитохрома С. После отделения негемовых белков, которое проводят при рН 3,8-4,0, к супернатанту добавляют 14-16 мл раствора, содержащего 0,3 М сульфата кадмия и 1,4 М иодида калия. Дальнейшая очистка проводится, как описано в примере 1. Выход составляет 405 мг, чистота продукта 99%.

П р и м е р 3. 2,5 кг сырой биомассы Candida valida ВСБ-94 обрабатывают, как указано в примере 1, используя 0,8 М хлорид натрия. Осаждение кадмиевого комплекса цитохрома С проводят раствором, содержащим 0,33 М хлорида кадмия и 1,6 М иодида натрия, Для обработки данного количества фильтрата необходимо 10-12 мл раствора. Растворение осадка и снятие цитохрома С с колонки осуществляется 0,4 М аммоний кар бонатным буфером, что позволяет поддерживать рН раствора цитохрома С в пределах 8,5-9,0. Дальнейшая очистка,

как в примере 1, Выход 395 мг, чистота продукта 99%.

П р и м е р 4. 2,5 кг сырой биомассы Candida vtllls ВСБ-651 обрабатывают и очищают, как указано в примере 1, используя

для экстракции 0,8 М хлорид натрия. Выход

цитохрома С составил 385 мг, чистота 99%.

П р и м е р 5. 2,5 кг сырой биомассы

Candida crusli ВСБ-729 обрабатывают, как

указано в примере 1. Осаждение кадмиевого комплекса цитохрома С проводят раствором, содержащим 0,3 М сульфата кадмия и 1,5 М иодида натрия, взятым в количестве 11 мл. Дальнейшая очистка осуществляется

по примеру 1. Выход 402 мг, чистота 99%.

Формула изобретения Способ получения цитохрома С из дрожжей вида Candida valida, предусматривающий дезинтеграцию клеток, экстракцию белков 0,8-1,0 молярным раствором хлорида натрия, фракционирование и концентрирование экстракта с помощью мембранной ультрафильтрации, хроматографическую

очистку на катионите и лиофильное высушивание, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, фракцию цитохрома С после ультрафильтрации подкисляют до рН 3,8-4,2 с последующим центрифу гиро ва н нем , супернатанта осаждают цитохром с добавлением раствора, содержащего 0.25-0,33 М соли кадмия и 0,5-1,6 М иодида натрия или калия, после чего осадок растворяют в 1-2%-ном растворе гидроксида аммония,

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве и научных исследованиях. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа. Цель достигается тем, что выделение заключается в дезинтеграции клеток, экстракции цитохрома C 0,8 - 1 М раствором хлорида натрия, после чего экстракт фракционируют и концентрируют с помощью мембранной фильтрации. Негемовые белки отделяют подкислением. Цитохром C осаждают в виде комплекса с кадмием, который затем разрушают гидроксидом аммония. Далее цитохром C очищают с помощью ионообменной хроматографии и лиофилизируют. Выход составляет 630 - 680 мг/кг сухой биомассы, чистота препарата 99%.