Способ получения биомассы возбудителя малярии РLаSмоDIUм FаLсIраRUм Советский патент 1990 года по МПК A61K39/02 C12N5/00 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к паразитологии.

Цель изобретения - повышение выхода биомассы возбудителя малярии P. falciparum.

Изобретение основано на методе частых пересевов со свежими отмытыми эритроцитами.

Используют 50%-ную суспензию эритроцитов человека. 5 - 10 мл крови человека переносят в,стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5-10 мин. -Плазму и лейкоцитарный слой удаляют пипеткой, а осажденные клетки ресус- пендируют в равном объеме RPM1-1640 без сыворотки с исходным рН 7,2 - 7,3. Затем еще дважды центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость. Клетки суспендируют в равном объеме

ЕРШ-1640 с 10%-ной сывороткой соответствующей группы Таким образом, получают 50%-ную суспензию эритроцитов. Культуральные клетки переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 3-4 мин со скоростью 1000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают, к осажденным эритроцитам добавляют равный объем полной питательной среды и получают 50%-ную суспензию клеток. После тщательного перемешивания в стерильных условиях к суспензии эритроцитов из культуры добавляют 50%-ную суспензию свежих отмытых эритроцитов, чтобы конечная па- разитемия была 0;3 - 0,5%. Затем, чтобы получить 10%-ную клеточную суспензию, прибавляют полную питательную среду RPM1-1640, HEPES (25 ммоль/л) + 10% сыворотки + 5% NajCO j, рн 7,2.

гл

э

W 1

Суспензию тщательно -перемешивают пастеровской пипеткой, разливают в куль- туральные чашки по 1 ,5 мл в каждую и продолжают культивирование. Оценку результатов производят в тонких мазках, подсчитывают паразитов на 1000 эритроцитов и выражают в процентах. При культивировании молярийньк паразисоставляет 10%) используют 20 - 25- кратное пропускание клеток через колонку с шестью капиллярными сужениями.

Пример. Из четырех культураль- ных чашек сливают содержимое в стерильную пробирку и перемешивают. Оп

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к паразитологии. Цель изобретения - повышение выхода биомассы возбудителя малярии PLASMODIUM FALCIPARUM. При пропускании суспензии эритроцитов через колонку-капилляр лизируются те клетки, которые являются непригодными для культивирования паразитов. Отличительным признаком способа является снижение гематокрита клеточной суспензии с 10 (до пропускания) до 6-8% (после пропускания). Оптимальное число пропусканий через колонку 20-25 раз. При соблюдении этих условий и последующем пересеве со свежими эритроцитами наблюдаются значительная стимуляция роста паразитов в культуре и увеличение выхода биомассы возбудителя малярии. 1 табл.

тов при высокой паразитемии, отсутст- JQ ределяют гематокрит полученной суспензии. Колонку предварительно стерилизуют, промывают средой и высушивают. С помощью большого шприца создают отрицательное давление и пропускают суспен15 зию через колонку. Пропускание повторяют 10 раз, после чего определяют гематокрит конечной суспензии. Если он снижается до 6 - 8%, то обработку останавливают. В противном случае

20 пропускают еще 5 раз и снова измеряют гематокрит, т.е. устанавливают зависимость конечного гематокрита от числа пропусканий. В дальнейшей работе пропускают суспензию фиксированное

25 число раз без определения гематокрита.

Пропускают через колонку 15 раз (А) суспензию с гематокритом 10% - гематокрит конечной суспензии не из30 меняется и составляет 10% (см. таблицу) . При пересеве этих клеток со свежими- эритроцитами подсчитывают пара- зитемию. Заметного размножения паразитов через 48 ч не происходит. Про35 пускают суспензию через колонку

20 раз - конечный гематокрит снижается до 8%. При пересеве э-тих клеток со свежими эритроцитами подсчитывают паразитемию. Рост паразитемии увели40 чивается в 6,6 раза (В). Пропускают суспензию через колонку 25 раз. Рост паразитемии увеличивается в 4 раза. Конечный гематокрит снижается до 6% (В).

45 Пропускают суспензию-через колонку 30 раз, происходит лизис зараженных эритроцитов (Г).

вии смены среды и т,д. происходит ухудшение состояния культуры: задержка роста и размножения паразитов,

Для коррекции этих неблагоприятных изменений обычно используют способ частых пересевов, однако положительный эффект, т.е. стимуляция роста паразитов наблюдается примерно в 50% случаев (в зависимости от исходного состояния паразитов). Присутствие хрупких эритроцитов, находящихся в предгемолитическом состоянии и не пригодных для развития в них паразитов, препятствует эффективному культивированию.

Согласно предлагаемому способу эритроциты пропускают через колонку- капилляр с последующим замещением л разрушенных клеток свежими эритроцитами Используют культуру, в которой наблюдается замедленное развитие паг разитов и встречаются патологические формы возбудителя,

Клетки переносят в центрифужную пробирку и затем пропускают через стеклянную колонку-капилляр длиной 300-350 мкм, имеющую 6-8 сужений капиллярного диаметра 80 - 100 мкм. Отверстия меньшего диаметра не пропускают суспензию, отверстия большего диаметра пропускают клетки свободно$ не вызывая лизиса. Толщина колонки 5 - 8 мм определяется требованиями технической прочности изделия.

Число пропусканий9 необходимое для удаления хрупких эритроцитов из культуры, подбирают для конкретных условий. При этом исходят из показателей гематркрита суспензии до и после пропускания. Гематокрит - отноше-i- ние объема (упакованных) интактнык эритроцитов к объему всей суспензии - определяют центрифугированием в узком капилляре.

Снижение величины гематокрита по мере пропускания клеток через колонку указывает на лизис эритроцитов. Для стандартных условий кулътивирова ния (гематокрит суспензии в культуре

50

55

Таким образом, эффект последующей стимуляции размножения возбудителя в культуре достигается при 2б - 25- кратных пропусканиях через колонку, при этом гематокрит суспензии снижается на 2 - 4%. Дальнейшее снижение гематокрита нецелесообразно, так как остается слишком мало клеток для пересева и, кроме того, начинают разрушаться эритроциты, содержащие возбудителей .

Таким образом, эффект последующей стимуляции размножения возбудителя в культуре достигается при 2б - 25- кратных пропусканиях через колонку, при этом гематокрит суспензии снижается на 2 - 4%. Дальнейшее снижение гематокрита нецелесообразно, так как остается слишком мало клеток для пересева и, кроме того, начинают разрушаться эритроциты, содержащие возбудителей .

После обработки суспензию центрифугируют, удаляют надосадок. К осад- ку приливают 5-кратный объем полной питательной среды. Затем центрифугируют, отбирают надоса.дочную жидкость К осадку добавляют 5-кратный объем полной питательной среды и центрифугируют в течение 3 мин со скоростью 1000 об/мин. Отмывание повторяют до удаления следов гемолиза.

После удаления надосадочной жидкости в пробирке остается 0,3 мл кле ток. Далее, чтобы получить 50%-ную суспензию, к осадку добавляют равный объем полной питательной среды. Тщательно перемешивают и готовят мазок, красят по Романовскому-Гимза и подсчитывают паразитемию.

Выход биомассы (т.е. количество паразитов на 1000 эритроцитов) значи

10 10 10 10

10 8 6

4

5657006

тельно выше (в 4-5 раз) при включении предлагаемого способа в процессе культивирования.

гФормула изобретения

Способ получения биомассы возбудителя малярии Plasmodium falciparums включающий получение суспензии -зараженных эритроцитов, культивирование возбудителя в питательной среде путем пересевов с добавлением свежих эритроцитов, о тличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы возбудителя, перед пересевом суспензию эритроцитов продавливают через колонку с микрокапиллярными су- спензиями, пропускающими эритроциты до получения 6-8% суспензии эритроцитов .

15812

20958

25743

30Лизис зараженных эритроцитов