Способ определения активности протеиназ Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 C12Q1/37 

Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к способам определения активности протеиназ, и может быть использовано при практических работах в энзимологической, пищевой и рыбообрабатывающей промышленности, и особенно для быстрого оп- ределенчя пригодности сырья для производства ферментных препаратов.

Цель изобретения -повышение точности и упрощение процесса.

Способ заключается в том, что ферментный раствор наносят на куски фильтровальной бумаги одинаковой площади и толщины. Этот прием исключает необходимость использования точной мерной посуды и обеспечивает оперативность выполнения определения. В качестве субстрата используют желатин, нанесенный ровным слоем, постоянной высоты на фотографические пластины. Замена быстропортящегося субстрата на стандартные пластины с желатиновым слоем избавляет работающих от необходимости частого приготовления реактива. Далее реакцию ферментного раствора с субстратом осуществляют путем накладывания смоченной раствором фермента фильтровальной бумаги на покрытую слоем желатина сторону фотографической пластины и выдерживания пластины в течение опредеиен- ного интервала времени. Такая организация анализа приводит к возможности его выполенич без специального оборудования (термостата) и подготовки работающих. Регистрацию степени гидролиза субстрата ведут по скоСП

05 &

СП

Јьсл

:

ости гидролиза желатина, а именно ПОУскорости образования прозрачных пятен под смоченной ферментным раствором фильтровальной бумагой,

Способ осуществляют следующим образом.

Кусочки фильтровальной бумаги одинаковой площади и толщины смачивают в экстракте протеиназ и быстро наклаывают рядами на матовую сторону фотопластины. Для получения одинаковых кусков бумаги удобно пользоваться канцелярским дыроколом, позволяющим получить кружки бумаги одинаковой площади. Фотопластину накрывают чашкой Петри и помещают горизонтально на рабочий стол. Температурный режим в процессе гидролиза обеспечивают настольной лампой на уровне 25t2°C, при необходимости опуская или поднимая ее.

Первый ряд кружков бумаги снимают через 10 мин, последующие - через каждые следующие 5 мин. Реакцию считают законченной при полном растворении желатинового слоя фотопластины и появлении на ней прозрачных пятен под одним из рядов кружков бумаги.

В табл. 1 приведены данные о величине активности протеиназ в зависи- мости от продолжительности растворения желатина.

Продолжительность определения активности протеиназ не превышает 50 мин.

Пример 1. Построение калибровочной кривой. Готовят растворы препарата протеолитических ферментов из креветки с концентрацией О,1 - 1,5 мг/мл. Экстракты протеиназ готовят непосредственно перед определением активности. Навеску анализируемого материала, взвешенную с точностью до 0,01 г, растирают в фарфороой ступке с водой. Гомогенат настаивают 30 мин в холодильнике при 2 С и фильтруют в пробирку через бумажный фильтр. Полученный фильтрат анализируют .

Кружки фильтровальной бумаги диаметром 5 мм вырезают из бумаги с помощью канцелярского дырокола, затем берут пинцетом, смачивают в экстракте протеиназ и быстро накладывают на. покрытую слоем желатина сторону фотопластины. На одну фотопластину на- кладывают пять вертикальных рядов кружков (по три кружка в одном ряду).

0

5

0

5

5

Фотопластину с кружками накрывают чашкой Петри во избежание высыхания экстракта, помещают на рабочий стол и выдерживают при 25±2°С. В случае пониженной температуры в рабочем помещении пластину обогревают настольной лампой. Для контроля за температурой с рядом пластиной помешают термометр . Для остановки реакции точно через 10 мин пинцетом снимают первый ряд бумажных кружков. Последующие ряды кружков бумаги, смоченной экстрактом протеиназ, снимают через каждые 5 мин.

Реакцию считают законченной при полном растворении желатинового слоя фотопластины и появлении на ней прозрачных пятен под одним из рядов кружков фильтровальной бумаги. Продолжительность реакции фиксируют. После снятия всех кружков пластину ополаскивают в кристалпизаторе с водой комнатной температуры и удаляют влагу фильтровальной бумагой. Для каждого из исследуемых растворов используют отдельную фотопластину.

Параллельно проводят определение протеолитической активности по модифицированному методу Ансона.

При построении калибровочной кривой или калибровочной таблицы величину интервала можно изменять с заданной степенью точности путем варьирования интервалов между наблюдениями, концентрации ферментного раствора и температуры проведения реакции. Таким образом, чувствительность метода предусматривает требуемую реальность условиями степень точности.

Пример 2. 1 г ферментного препарата из креветки, взвешенный с точностью до 0,01 г, диспергируют в 9 мл воды, настаивают 30 мин в холодильнике и фильтруют через бумажный фильтр в стеклянную пробирку.

Определяют разведение

0

5

С

- 10

1 + 9 .

(удельную массу воды принимают равной 1,0 г/см3).

Из фильтровальной бумаги вырезают с помощью канцепярского дырокола кружки диаметром 5 мм.

Кружки берут пинцетом, смачивают в фильтрате ферментного раствора, накладывают на матовую сторону фотопластины, расположенной на горизонтальной поверхности. На одну фотопластину накладывают пять вертикальных кружков (по три кружка в .одном ряду). Фотопластину с кружками накры вают чашкой Петри во избежание высыхания экстракта протеинаэ.

Для остановки реакции точно через 10 мин пинцетом снимают первый ряд бумажных кружков. Последующие ряды кружков снимают через каждые 5 мин. Прозрачные пятна под кружками появились в 4 ряду, т.е. через 25 мин. По табл. 1 определяют активность про теиназ в единице объема ферментного раствора (ПА 2,3 - 3,5 ед/см3). В пересчете на 1 г препарата ПА 23 - 35 ед/г.

П р и м е р 3. 0,5 мг препарата трипсина, взвешенного с точностью до 0,01 г, диспергируют в 10 мл воды, настаивают 30 мин при 4° С, фильтруют через бумажный фильтр.

Определяют разведение 10000 + + 0,5/0,5 20000.

Определение активности проводят также, как описано в примере 1.

Прозрачные пятна под кружками смоченной ферментным раствором бумаги появляются через 45 мин. По таблице определяют активность протеиназ в единице объема раствора трипсина (ПА 0,4 - 0,6 ед/смэ). В пересчете на 1 г трипсина ПА 8000 - 12000 ед/г

1

Пример4. 5г измельченных внутренностей зубана, взвешенных с точностью до 0,01 г, растирают в фарфоровой ступке с 10 мл воды. Го- могенат настаивают 30 мин в холодильнике и фильтруют.

Разведение 5 10/5 3Определение активности проводят также, как описано в примере 1. Прозрачные пятна под кружками смоченной экстрактом фильтровальной бумаги появились в 9 ряду, т.е. через 50 мин. По таблице определяют активность протеиназ в 1 см5: 0,3 - 0,4 ед/см , что составляет с учетом разведения внутренностей зубана ПА 0,9 - 1,2 ед/г.

П р и м е р 5, 1 г протосубтилина растворяют в 9 мл воды, диспергируют, настаивают и фильтруют в пробирку. Определение активности проводят также, как в примере 1.

Прозрачные пятна появились в 1 ряду, т.е. через 10 мин. Это значит,

10

564545«

что ПА Ј 8,37 ед/см3. С учетом разведения определяют ПА 83,7 ед/г. i П р и м е р 6 (контрольный). На матовую (платиновую) сторону фотопластины, расположенной на поверхности рабочего стола, наносят микропипеткой 0,2; 0,4; 0,6 мл биологической жидкости креветки. На одну сторону фотопластины наносят пять вертикальных рядов капель (по три капли в одном ряду) и наблюдают за появлением прозрачных пятен под каплями. Через 50 мин наблюдают образование прозрачных пятен. К этому моменту биологическая жидкость подсыхает, сохраняя постоянный диаметр пятна, соответствующий диаметру растекшейся капли.

В табл. 2 приведены результаты определения протеолитической активности ферментного препарата креветки по методу Аструпа (субстрат - желатин) .

Ход анализа по известному способу позволяет определить присутствие протеин з в биологической жидкости креветки, но не дает основание судить о ее величине. Растворы различной концентрации гидролизуют желатину за разное время, диаметр пятна под каплей сохраняет стабильные режимы.

15

20

25

30

Таким образом, преимуществом предлагаемого способа по сравнению с известным является возможность не только качественной, но и количественной оценки протеолитической активности. Способ прост и применим в судовых условиях, позволяет определять активность протеиназ без использования специального оборудования и с достаточной точностью.

Формула изобретения

Способ определения активности протеиназ, включающий получение ферментного раствора, проведение фер- ментативной реакции с твердым субстратом с последующей регистрацией степени гидролиза субстрата, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения процесса, полученным ферментным раствором пропитывают куски фильтровальной бумаги одинаковой площади и толщины, реакцию проводят путем взаимодействия пропитанной ферментным раствором

715645458

фильтровальной бумаги с желатиновым дут по образованию прозрачных пятен

Изобретение относится к биохимическому анализу при проведении практических работ в пищевой и рыбообрабатывающей отраслях промышленности. Цель изобретения - повышение точности и упрощение процесса определения активности протеиназ. Способ заключается во взаимодействии ферментного раствора с желатином фотопластины и регистрации степени гидролиза субстрата по скорости растворения желатина. Реакцию проводят путем накладывания пропитанных ферментным раствором кусков фильтровальной бумаги на фотопластину. 2 табл.

слоем, нанесенным на фотопластины, а регистрацию степени гидролиза веСоствитель А.Карякин Редактор Т.Парфенова Техред Л.Сердюкова

Заказ 1156

Тираж 514

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

на фотопластине под фильтровальной бумагой.

Т а.б л и ц а 1

Таблица2

Корректор С.Шекмар

Подписное