Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к @ -интерферону человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения содержания у-интерферона в биологических жидкостях и в культуральной среде.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus - продуцента моно- клональных антител (Мои AT), специфичных к у-интерферону человека.

Штамм получают следующим образом.

Клетки мышиной миеломы SP2/0. Ад 14 гибридизуют с клетками селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной реком- бинантным у -интерфероном человека по схеме, обеспечивающей максимальный иммунный ответ для слабых антигенов. Предварительно подбирают оптимальные условия для слияния спленоцитов с клетками миэломы, что обеспечивает высокую степень гибридизации клеток. В результате селекции полученных гибридных клеток на среде ГАТ, скрининга гибридов по признаку продукции антител к у -интерферону и последующего клонирования отбирают штамм 159Д (авторское наименование у-745), стабильно продуцирующий Мон AT к у-интерферону.

Штамм хранится в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР - ВСКК(П). Регистрационный номер депонирования 159Д. К моменту

сл

VI

о

( со

депонирования штамм продуцирующий Мои АТ шел 15 пассажей. Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования - среда RPM1 1640 с добавлением следующих аминокислот, мг на 1 л среды: L-аланина 8,9; L-аспараплна; Н2015.0; L-аспарэгино- вой кислоты 13,0; глицина 7,5; L-глютамино- вой кислоты 14,7; L-пролина 11,5; L-серина 10,5, а также 50 мкм 2-меркаптоэтанола и 10% сыворотки плода коровы.

Клетки культивируют в пластиковой или стеклянной посуде в закрытой системе или в атмосфере 5%-ной СОа при 27°С. При росте на указанной среде штамм образует округлые клетки. Время удвоения популяции 24-30 ч. Клетки пассируют 2-3 раза в неделю. Кратность рассева 1:2.

Культивирование в организме животных. Прививка гибридных культивируемых клеток штамма 159Д сингенным мышам линии BALB/c вызывает у них образование асцитной опухоли. В асцитной жидкости содержатся Мон AT ку-интерфероны. Способность к продукции Мон AT стабильно сохраняется на протяжении по крайней мере 15 пассажей в культуре и 2 пассажей при перевивках на животных (срок наблюдения), а также при переводе асцитных клеток на обычную ростовую среду. Штамм продуцирует Мон AT, относящиеся к классу IgG. Продуктивность штамма. При стандартных условиях культивирования штамма 159Д продуцирует Мон AT в количестве 3-10 мкг/мл среды в зависимости от условий культивирования. Решающее значение имеет качество сыворотки плода коровы.

При культивировании штамма 159Д п vivo от одной мыши можно получить 3-7 мл асцитической жидкости (в среднем 5 мл) с содержанием Мон AT к у -интерферону 3-5 мг/мл (в среднем 4 мг/мл).

Для получения больших количеств Мон AT целесообразно использовать культивирование штамма In vivo с последующим извлечением Мон AT из асцитической жидкости.

Криохонсервация проводится в смеси равных объемом кондиционированной ростовой среды и 20%-ного диметилсульфокси- да на ростовой среде при концентрации 0,5 -1-106 клеток в 1 мл. Режим замораживания: 1° в мин от 20° до минус 60°С, 10° в мин от минус 60° до 100°С, 50° в мин от минус 100° до минус 150°С. Клетки хранят в жидком азоте. Отогревают при 40°С в течение 1-2 мин; далее разбавляют 10-кратным объемом среды, центрифугируют 5 мин при

1000 об/мин и высевают в ростовую среду. Жизнеспособность клеток штамма 159Д после размораживания, определенная по включению трипанового синего, 60-70%. Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Микоплазма не выявлена по включению тимидиновой метки.

Пример. Каждая мышь линии BALB/c предварительно получает внутрибрюшинно 0 по 0,5 мл пристана. Через 8-10 дней подготовленным таким образом животным внутрибрюшинно вводят гибридные клетки, полученные из асцитической жидкости мышей - носителей опухоли. Для этого из 5 брюшной полости мыши извлекают 5,2 мл асцитической жидкости, которую стерильно центрифугируют 7 мин при 1000 об/мин на центрифуге К-23. Осадок клеток отмывают стерильным фосфатным буферным раство- 0 ром (0,02 М фосфатный буфер с 0,14 М NaCI, рН 7,2) и повторно центрифугируют в том же режиме. Осадок ресуспендируют в 1,5 мл фосфатного буфера и проводят подсчет клеток в камере Горяева. Каждой из трех взятых 5 в опыт мышей вводят 2,5x10 клеток в объеме 0,5 мл. Спустя 9 дней мышей забивают и из брюшной полости извлекают асцитиче- скую жидкость. Всего от трех мышей получено 14,9 мл асцитичес кой жидкости (3,8 + 4,9 0 +6.2).

Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и используют для дальнейших перевивок гибридомы, а из насадочной жидкости извлекают Мон AT. 5 С помощью стандартного твердофазного иммуноферментного метода установлено, что полученная асцитическая жидкость содержит Мон AT к у - интерферону. К препарату у-интерферона, собированному 0 в лунках платы для иммунологических исследований, добавляют разведенную асци- тическую жидкость. После инкубации и соответствующих отмывок в лунки добавляют коньюгированные с перексидазой хрена 5 кроличьи антитела и против мышиных иммуноглобулинов. По окончании фермента- тивной реакции расцепления N262 в присутствии диаминобензимида развивающуюся окраску регистрируют на спектрофотометре 0 Мультискан при длине волны 450 нм. Связывание Мон AT с интерфероном обнаружено при разведении асцитической жидкости до Ю 5.

Для получения Мон AT из асцитической 5 жидкости иммуноглобулины осаждают сульфатом аммония до 50% насыщения. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 20 мМ фосфатного буфера с 0,14 М NaCI и обессоливают на колонке РД 10. Белковый

раствор наносят на колонку моно QHR 5/5, являющуюся частью системы быстрой жидкостной хроматографии. За один проход из раствора иммуноглобулинов, соответствующего 0,5 мл асцитической жидкости, элюи- руют 2 мг Мон AT. Таким образом, при культивировании гибридомы штамма 159Д в виде асцитной формы опухоли выход Мон AT около 20 мг/мышь. ч

Характеристика Мон AT, продуцируемых штаммом гибридомы 159Д.

Мон AT, секретируемые в асцитическую жидкость клетками гибридомы штамма 159Д, связываются как с нативным у-интер- фероном человека, полученным из донорской крови, так и с рекомбинантным у-интерфероном, полученным от бактериальных процуцентов. Связывание Мон AT с указанными препаратами у-интерферона установлено в тесте твердофазного иммуно- ферментного анализа, а также методом им- муноблотинга.

По данным электрофореза в полиакри- ламидом геле Мон AT, продуцируемые клетками гибридомы штамма 159Д, относятся к классу IgG.

Характерной особенностью Мон AT, продуцируемых гибридомой 159Д, является

то, что они узнают в молекуле рекомбинан- тного у-интерферона эпитоп, локализованный вне С-концевой последовательности из 15 аминокислот.

Другая особенность Мон AT состоит в

том, что они оказываются способными взаимодействовать с у-интерфероном, уже сорбированным на других Мон AT (полученных от гибридомы штамма 158Д). Это обстоятельство открывает возможность использования антител, продуцируемых штаммом гибридомы 159Д, для изготовления тест-набора для количественного определения у-интерферона в биологических жидкостях и

культуральной среде. При этом Мон AT, продуцируемые штаммом 159Д, должны использоваться в иммуноферментном или радиоиммунном методах анализа в качестве вторых (верхних) или индикаторных антител

в виде конъюгата с ферментом или с радиоактивной меткой.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых кле- ток животных Mus musculus BCKK (П)-159Д, используемый для получения моноклональ- ных антител к у-интерферону человека.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения содержания γ-интерферона в биологических жидкостях и в культуральной среде. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, продуцирующего моноклональные антитела (Мон АТ), специфичные к γ-интерферону человека. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей, линии BALB/с, иммунизированных рекомбинантным γ-интерфероном человека, с клетками миеломы SP2/О AG 14. Клетки культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением некоторых аминокислот, а также 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 10% сыворотки плода коровы при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Клетки пассируют 2-3 раза в неделю

кратность рассева 1:2. Штамм продуцирует Мон АТ, относящиеся к классу IG G. Секреция Мон АТ на третий-четвертый день культивирования составляет 3-10 мкг/мл среды и 3-5 мг/мл асцитической жидкости. Мон АТ специфически взаимодействует с γ-интерфероном человека, а также с рекомбинантным γ-интерфероном.