Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый для получения моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

о

Јъ

Изобретение относится к гибри- домной технологии и вирусологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента эукариотической РНК-полимеразы. Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (Мон AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7. Штамм получают гибридизацией силено- цитов мышей линии BALB/C, иммунизированных очищенным препаратом РНК- полимеразы, бактериофага Т7, с клетками мышиной миеломы линии X 63. АГ 8.653. Клетки культивируют в среде ДМЕМ с эмбриональной сывороткой коров (10%), глютамином (2 ммоль), пируватом натрия (1 ммоль), 2-мер- каптоэтанолом (0,05 ммоль), пенициллином/стрептомицином (1000 ед./мл). Частота пассирования 2-3 раза в неделю, посевная- доза 150 тыс. клеток на 1 мл, кратность посева 5-10 раз. Продуктивность штамма 10 (по ELISA) в культуральной среде и 3 х 10 в асцитической жидкости. Мон AT, секре- тируемые штаммом, специфически взаимодействуют с РНК-полимеразой бактериофага Т7. Штамм депонирован под номером BCKK(II)-3S2 D. Мон AT относятся к классу Jg G1. W

Изобретение относится к гибридной биотехнологии и вирусологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента эукариотической РНК-полимеразы.

Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (Мон AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7.

Штамм получают следующим образом.

Восьмйнедельпых мышей линии BALB/C иммунизируют в пятки задних

лап по 35 мкг антигена с полым адью- вантом Фрейнда. Через 4 недели мышей иммунизируют подкожно в несколько мест вдоль спины, шеи и туловища 50 мкг антигена в неполном адыованте Фрейнда. Через 4 недели вводят 50 мкг антигена внутрибрюшинйо без адь- юванта. Через 10 дней неиммунные мыши линии BALB/C летально облучают (750 рад) на рентгеновской установке, которым через 24 ч после облучения внутривенно вводят лимфоциты, полусл

оо

ченные из селезенки иммунной мыши. Одновременно мышам подкалывают по 30 мкг антигена внутрибрюшинно. Четыре дня спустя после трансплантации лимфоцитов ставят слияние.

Титр антител, специфичны к ДНК- зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7, составляет в сыворотке подопытной мыши 1:2000 при определении с помощью твердофазного иммунофер- ментного анализа.

Слияние спленоцитов с клетками мышиной мнеломы линии Х63.АГ8.653 проводят с помощью ПЭГ фирмы Merk (ФРГ) с мол.массой 4000, Отношение числа клеток миеломы к числу спленоцитов составляет 1:1. После слияния клетки вносят в лунки 96-луночных панелей. За сут до слияния в лунки 96-луночных панелей высаживают селезеночные клетки (2 млн кл,/мл по 100 мкл на 1 лунку). Селекцию гибридных клонов проводят на среде ГАТ (Litilefield, I.W., Science, 1964, v. 145, p. 709-710), приготовленной на среде ДМЕМ с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки и 40 мкг/мл антибиотика гентамицина. Клетки культивируют в инкубаторе с 6%-ным содержанием COg в атмосфе ре,Клоны гибридных клеток появляются через неделю в 60% лунок.

Через 14-17 дней тестируют куль- туральные жидкости из лунок с клонами на присутствие специфических антител методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.

Клонирование положительных культур проводят методом предельных разведений, внося 0,5 клетки на одну лунку 96-луночного плейта с питающим слоем селезеночных клеток. Клон ИМБ-7Сл отобран как лучший продуцент моноклональных антител и повторно клонирован по той же схеме, что и в первый раз. Один иэ реклонов, характеризующийся максимальной активностью и образованием асцитных опухолей у 100% привитых мышей BALB/C, назван ИМБ-7С9.

Штамм клеток ИМБ-7С- депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером BCKK(II) № 352Д. .

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Суспензионная культура, состоящая из круп

5

0

5

0

5

0

5

0

ных округлых клеток с крупными ядрами и тонким ободком цитоплазмы. Ядрышки крупные, по 1-2 в ядре.

Культуральные признаки. Среда для культивирования - среда ДМЕМ с сывороткой эмбриона коровы (10%), сывороткой новорожденных телят (10%), глютамином (2 ммоль), пируватом натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанолом (0,05 ммоль), пенцилин/стрептомици- ном (1000 ед/мл). Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия - встряхивание. Частота пассирования 2-3 раза в неделю. Посевная доза 150 тыс. клеток на 1 мл. Кратность рассева 5-10 раз.

Контаминация. Бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.

Культивирование in vivo. Культура прививается и растет в виде асцита в перитонеальной полости мышей BALB/C. За 7 дней введения клеток мышам-реципиентам вводят по 0,5 мл пристана. Асцит образуется через 10-14 сут после введения 1-5млн клеток.

Продуктивность штамма. Первичная культура моноклональна. Проведено два клонирования. Все клоны позитивны. На протяжении 30 пассажей клона ИМВ-7С интенсивность продукции антител не изменялась (титр антител по ELISA в культуральной среде 10 , а в асцитической жидкости 2x10). Мои AT относятся к классу иммуноглобулинов G1.

Консервация клеток. Клетки ИМБ-7С заморожены на 36-м пассаже. Общее количество ампул 20, по 4 млн клеток в ампуле. Криозащитная среда - ростовая,

П р и м е р 1. Кулътивироаание гибридных клеток ИМБ-7С9.

Во флаконы для культивирования клеток вносят гибридные клетки в концентрации 100-200тыс клеток в 1 мл среды ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки коровы, 10% сыворотки новорожденных телят, 2 ммоль глютамина, 1 ммоль пирувата натрия, 0,05 ммоль 2-меркаптоэтанола, 1000 пенициллина/стрептомицина. Клетки инкубируют 2-3 сут в стационарном состоянии при 37РС в атмосфере 6% С0а, Концентрация клеток, превышающая 1 млн в 1 мл, неблагоприятна для роста клеток и вызывает их гибель, Культуральнущ

51

жидкость из флаконов с трехдневной; культурой тестируют на присутствие Мои AT. При посеве клетки встряхивают, разбавляют ростовой средой до указанной концентрации ч разливают по флаконам.

П р и м е р 2, Культивирование ги ридомных клеток ИМБ-7С.

Клетки, растущие в культуралышх флаконах, через 1-2 сут после пересева центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Клетки должны быть в концентрации, не превышающей 500 тыс/мл т.е.находиться в логарифмической фазе роста. Клеточный осадок после ценрифугирования ресуспендируют в определенном объеме культуральной среды без сыворотки и подсчитывают число жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего. Доводят концентрацию клеток до 1-10 млг/мл и вводят в брюшную полость мышей BALB/C, предварительно обработанных пристанем. Обработку проводят однократно за 1- 3 недели до введения гибридомных клеток путем инъекции 0,5 мл приста- на. Через 1-3 недели (зависимости от числа введенных клеток) образуются асцктные опухоли у 100% привитых мышей BALB/C, Количество асциткой жидкости, накапливающейся в брюшной полости мышей после введения им гибридомных клеток ШБ-7Сд (в среднем по 20 животным), составляет 5 мл. Содержание Мои AT в 1 мл асцитной жидкости составляет 10-20 мг.

П р и м е р 3. Использование мо- ноклональных антител ИМБ-7С иммуно- ферментном анализе.

Для определения активности взаимодействия ИМБ-7С9 с антигенными детерминантами ДНК-зависимой РНК-по

10

15

0

01

5

0

5

0

586

лимеразы бактериофага Т7 применяют метод непрямого твердофазного анализа. В качестве твердой фазы используют 96-луночные пластины, сенсибилизированные РНК-полимераэой фага Т7 (2,5 мкг/мл белка, по 100 мкл раствора на 1 лунку). Далее в лунки пластин вносят по 100 мкл раствора ас- тической жидкости в необходимом разведении в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 150 мы NaCl, pH 7,4 (ЗФР). Для снижения неспецифического взаимодействия в ЗФР добавляют до 0,1% детергена Твин-20 (ЗФР-Т) и до 0,2% бычьего сывороточного альбумина. Пластины инкубируют 1 ч при 37°С и трижды промывают буфером ЗФР, содержащим 0,05% ЗФР-Т. После этого в лунки вносят по 100 мкл коньюгата кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена и инкубируют л ч при 37°С. После шестикратной промывки ЗФР-Т в лунки вносят хромагенный субстрат (0,005М 2,2-азино-ди-(3-этилбензтиа- золик-6-сульфонат) (Нп) и 0,01%-ную s 055 M цитратном буфере (рН 4,0). Оптическую плотность субстратной смеси в лунках регистрируют при 405 нм с помощью восьмиканального фотометра.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой, специфически обнаруживают ДНК-зависимую РНК-полиме- разу бактериофага Т7.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых кле- .. ток животных Mus musculus L BCKK(ll)- -352 Д,используемый дгя получения моно- клональных антител к ДНК-зависимой РНК- полимеразе бактериофага Т7.