Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к @ -интерферону человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения содержания J-интерферона человека в биологических жидкостях и в культуральной среде.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего моноклональные антитела, специфичные к X-интерферону человека.

Штамм получают следующим образом.

Клетки мышинной миеломы Sp 2/0-Ag Ц гибридизуют с клетками селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной рекомбинатным У-интерфероном человека по схеме, обеспечивающей максимальный иммунный ответ дня слабых антигенов. Предварительно подбирают оптимальные условия для слияния спле- ноцитов с клетками миеломы, что обеспечивает высокую степень гибридизации клеток. В результпге сепекции полу10

ченных гибридных клеток на среде ГАТ, скрининга гибридом по признаку продукции антител к Ј-интерферону и последующего клонирования отбирают штамм (авторское наименование У -89), стабильно продуцирующий мон AT к интерферону.

Штамм ВСКК(П)-158Д хранится в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР. К моменту депонирования штамм прошел 12 пассажей.

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирова- 15 ния - среда RPMI с добавлением следующих аминокислот, мг на 1 л среды: L-аланин 8,9; L-аспарагин 15,0; L-аспарагиновая кислота 13,0; глицин 7,5; L-глютаминовая кислота 20 И,7; L-пролин 11,5; L-серин 10,5, а также 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 10% сыворотки плода коровы.

Клетки культивируют в пластиковой или стеклянной посуде в закрытой сие- 25 теме или в атмосфере 50%-ной С0а при 37°С. При росте на указанной среде штамм образует округлые клетки. Время удвоения популяции ч. Клетки пассируют 2-3 раза в неделю. Крат- зо ность рассева 1:2.

Культивирование в организме животных.

Прививка гибридных культивируемых клеток штамма 158Д сингенным мышам линии BALB/c вызывает у них образование асцитной опухоли. В асцитной жидкости содержатся мон AT к Я-интерферону. Способность к продукции мон AT стабильно сохраняется на про- 40 тяжении по крайней мере 12 пассажей в культуре и 2 пассажей при перевивках на животных (срок наблюдения), а также при переводе асцитных клеток

интерферону 3-5 мг/мл (в среднем I мг/мл) .

получения больших количеств мон AT целесообразно использовать культивирование штамма in vivo с последующим извлечением мон АН из асци- тической жидкости.

Криоконсервирование.

Криоконсервацию проводят в смеси равных объемов в кондиционированной ростовой среды и 20%-ного диметил- сульфоксида на ростовой среде при концентрации 0,5106 кл. в 1 мл. Ре35

жим замораживания: 1 град в 1 мин от (-20 до минус 60°С, 10 град в 1 мин от минус 60 до синус 100°С, 50 град в 1 мин от минус 100 до минус 150°С. Клетки хранят в жидком азоте. Отогревают при 0°С в течение 1-2 мин, далее разбавляют 10-кратным объемом среды, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и высевают в ростовую среду. Жизнеспособность клеток штамма 158Ц после размораживания, определенная по включению трипанового синего, составляет 60-70%. I

Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Микроплазма не выявлена по включению тимидиновой метки.

Пример. Каждая мышь линии BALB/c предварительно получают внут- рибрюшинно по 0,5 мл пристана. Через 8-10 дней подготовленным таким образом животным внутрибрюшинно вводят гибридные клетки, полученные из асци- тической жидкости мышей - носителей опухоли. Для этого из брюшной полости мыши извлекают 5,5 мл асцитичес- кой жидкости, которую стерильно центрифугируют 7 мин при 1000 об/мин на центрифуге К-23 (ГДР). Осадок клеток

на обычную ростовую среду. Штамм про- д5 отмыва10т стерильным фосфатным буферным раствором (0,02 М фосфатный буфер с 0,Й М NaCl, pH 7,2) и повторно центрифугируют в том же режиме. Осадок ресуспендируют в 1,5 мл фосфатного буфера и проводят подсчет клеток в камере Горяева. Каждой из трех взядуцирует мон AT относящиеся к классу. Ig G.

Продуктивность штамма.

При стандартных условиях культивирования штамм продуцирует мон АН в количестве 3-Ю мкг/мл среды в зависимости от условий культивирования. Решающее значение имеет качество эмбриональной телячьей сыворотки.

При культивировании штамма 1 58Д in vivo от одной мыши можно получить 3-7 мл асцитической жидкости (в среднем 5 мл) с содержанием мон AT к У 50

55

тых в опыт мышей вводят 2,510 клеток в объеме 0,5 мл. Спустя 12 дней мышей забивают и из брюшной полости извлекают асцитическую жидкость. Всего от трех мышей получают 16,6 мл асцитической жидкости (3,5+6,3+6,8). Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и исполь10

интерферону 3-5 мг/мл (в среднем I мг/мл) .

получения больших количеств мон AT целесообразно использовать культивирование штамма in vivo с последующим извлечением мон АН из асци- тической жидкости.

Криоконсервирование.

Криоконсервацию проводят в смеси равных объемов в кондиционированной ростовой среды и 20%-ного диметил- сульфоксида на ростовой среде при концентрации 0,5106 кл. в 1 мл. Ре50

5 о

0

5

жим замораживания: 1 град в 1 мин от (-20 до минус 60°С, 10 град в 1 мин от минус 60 до синус 100°С, 50 град в 1 мин от минус 100 до минус 150°С. Клетки хранят в жидком азоте. Отогревают при 0°С в течение 1-2 мин, далее разбавляют 10-кратным объемом среды, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и высевают в ростовую среду. Жизнеспособность клеток штамма 158Ц после размораживания, определенная по включению трипанового синего, составляет 60-70%. I

Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Микроплазма не выявлена по включению тимидиновой метки.

Пример. Каждая мышь линии BALB/c предварительно получают внут- рибрюшинно по 0,5 мл пристана. Через 8-10 дней подготовленным таким образом животным внутрибрюшинно вводят гибридные клетки, полученные из асци- тической жидкости мышей - носителей опухоли. Для этого из брюшной полости мыши извлекают 5,5 мл асцитичес- кой жидкости, которую стерильно центрифугируют 7 мин при 1000 об/мин на центрифуге К-23 (ГДР). Осадок клеток

тых в опыт мышей вводят 2,510 клеток в объеме 0,5 мл. Спустя 12 дней мышей забивают и из брюшной полости извлекают асцитическую жидкость. Всего от трех мышей получают 16,6 мл асцитической жидкости (3,5+6,3+6,8). Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и исполь1

зуют для дальнейших перевивок гибри- домы, а из надосадочной жидкости извлекают мон AT.

С помощью стандартного твердофазного иммуноферментного метода устанавливают, что полученная асцитичес- кая жидкость содержит мон ДТ к J- интерферону. К препарату У -интерферона , сорбированному и лунках платы для иммунологических исследований, добавляют разведенную асцитическую жидкость. После инкубации и соответствующих ОТМЫВОК В ЛуНКИ ДобиВЛЯЮТ кснъюгированные с пероисицазой хрена кроличьи антитела против мышиных иммуноглобулинов. По окончании ферментативной реакции расщепления в присутствии диаминобензидина развивающуюся окраску регистрируют на спектрофотометре Мультискан при длине волны 50 нм. Связывание мон AT с интерфероном обнаруживают при разведении асцитической жидкости до .

Цля получения мон AT из асцитической жидкости иммуноглобулины осаждают сульфатом аммония до 50%-ного сыщения. Осадок отделяют центрифугированием, раствосяют в 20 мМ фосфатном буфере с 0,1 М NaCl и обессоливают на колонке PR10. Белковый раствор наносят на колонку моно QHR 5/5, являющуюся частью системы быстрой жидкостной хроматографии. За один проход из раствора иммуноглобулинов, соответствующего 0,5 мл асцитической жидкости, элюируют 2 мг мон AT. Таким образом, при культивировании гиб- ридомы штамма 158/1 а виде асцит ной формы опухоли выход мон AT составляет около 22 мг/мышь.

Характеристика мон AT продуцируемых штаммом гибридомы 158Д.

Мон AT, секретируемые в асцитическую жидкость клетками штамма 158Д, связываются как с нативным jt -интер676 6

фероном человека, полученным из донорское крови, так и с рекомбинэнт- ным у-интерфероном, полученным от бактериальных продуцентов. Связывание мон AT с указанными препаратами Х-интерферона установлено в тесте твердофазного иммуноферментного анализа, а также методом иммуноблотинга.

По данным электрофореза в полиак- риламидном геле мон AT, продуцируемые клетками штамма 158/1, относятся к классу IgH.

Характерной особенностью мон AT, j - продуцируемых гибридомой 158/1, является то, что эти мон AT узнают эпи10

топ, локализованный в С-концевом участке молекулы рекомбинантного - интерферона.

Другая особенность мон AT, проду- ДУЦИруемых клетками гибридомы штамма 158Ц, состоит в том, что эти антитела, будучи в иммобилизованном состоянии, сохраняют способность связывать

Y-интерферон. Поскольку они отличаются от мон AT штамма 1591 по участку связывания на молекуле у-интерферона, то это означает, что мон AT от штамма 158Д можно использовать вместе с мон AT от штамма 159П в тест- наборе для количественного определения У-интерферона в биологических жидкостях и культуральной среде. При этом мон AT, продуцируемые штаммом 158ц, при использовании в иммуно- ферментном или радиоиммунном методах должны сорбироваться на твердой фазе в качестве первых антител.

40

ф о о м у л а изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П)- 158Д, используемый для получения моноклональных антител к у-интерферону человека.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения содержания γ-интерферона в биологических жидкостях и в культуральной среде. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего моноклональные антитела (Мон АТ), специфичные к γ-интерферону человека. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных рекомбинантным γ-интерфероном человека с клетками миеломы SP 2/O ^. AG 14. Клетки штамма ВСКК(П) N 158Д культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением некоторых аминокислот, а также 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 10% сыворотки плода коровы при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Клетки пассируют 2 - 3 раза в неделю, кратность рассева 1:2. Штамм продуцирует Мон АТ, относящиеся к классу JGG. Секреция Мон АТ на 3 - 4 день культивирования составляет 3 - 10 мкг/мл среды и 3 - 5 мг/мл асцитической жидкости. Мон АТ специфически взаимодействуют с γ-интерфероном человека, а также с рекомбинантным γ-интерфероном. Мон АТ узнают эпитоп, локализованный в C-концевом участке молекулы рекомбинантного γ-интерферона.