Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый для получения моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7 Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

1

(21)4685570/13

(22)25.04.89

(46) 07.04.91. Бюл. № 13

(71)Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта

(72)И.Л.Дегтярев, Д.А.Костюк и С.Н.Кочетков

(53) 578.085.23(088.8)

(56)Carroll S.B., Stollar B.D. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, p. 7233-7237.

.(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L, ИС- ГОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛО- НАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ДНК-ЗАВИСИМОЙ РНК ГОЛИМЕРАЗЕ БАКТЕРИОФАГА Т7

(57)Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента эукариотической РНК- полимеразы. Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела

(Мрн AT) и РНК-полимеразе бак$риофа- га Т7. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных очищенным препаратом РНК-полимеразы бактериофага Т7, с клетками мышиной миеломы линии Х63,АГ 8.653. Клетки культивируют в среде ДМЕМ с эмбриональной сывороткой коров (10%), глютамином (2 ммоль), пируватом натрия (1 ммоль), 2-мер- каптоэтанолом (0,05 ммоль), пенициллином/стрептомицином (1000 ед./мл). Частота пассирования 2-3 раза в неделю, посевная доза 150 тыс. клеток на 1 мл, кратность посева 5-10 раз. Продуктивность штамма 10 (по ELISA) в культуральной среде и 3 х 105 в асцитической жидкости. Мои AT, секре- л тируемые штаммом, специфически в за- имодействуют с РНК-полимеразой бакте- риофага Т7. Штамм депонирован под

номером BCKK(II)-351D. Мон AT относят- § ся к классу IgG1.

I

Изобретение относится к гибридрм- ной технологии и может быть исполь-- зовано для повышения качества выделяемого фермента зукариотической РНК-полимеразы.

Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (Мои AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7.

Штамм получают следующим образом.

Восьминедельных мышей линии BALB/C иммунизируют в пятки задних лап по 35 мкг антигена с полным адь-

ювантом Фрейнда. Через 4 нед. мышей иммунизируют подкожно в несколько мест вдоль спины, шеи, туловища О 50 мкг антигена в неполном адьюванте Фрейнда. Через 4 нед. вводят 50 мкг антигена внутрибрюшинно без адьюван- та. Через 10 дней неимунные мыши линии BaLB/C летально облучают(750 рад) на рентгеновской установке, через 24 ч после облучения им внутривенно вводят лимфоциты, полученные из селезенки иммунной мыши. Одновременно мышам подкалывают по 30 мкг антигена

СП

1

тчнутрибрюшинно. Четыре дня спустя после трансплантации лимфоцитов ставят слияние,

Титр антител, специфичных.к ДНК- зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7, составляет в сыворотке подо™ пытной мыши 1s2000 при определении с помощью твердофазного иммунофермент- ного анализа.

Слияние спленоцитов с клетками мышиной мнеломы линии Х63.АГ8.653 проводят с помощью ПЭГ с мол.маемой .4000, Отношение числа клеток мие- ломы к числу спленоцитов составляет 1:1. После слияния клетки вносят в лунки 96-луночных панелей. За 1 сут до слияния в лунки 96-луночных панелей высаживают селезеночные клетки (1 млн кл./мл по 100 мкл на 1 лунку) Селекцию гибридомных клонов проводят на среде ГАТ, приготовленной на среде ДМЕМ с добавлением 20%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и 40 мкг/мл антибиотика гентамицина. Клетки культивируют в инкубаторе с содержанием СО, в атмосфере. Клоны гибридных клеток появляются через неделю в 60% лунок.

Через 14-17 дней тестируют культу- ральные жидкости из лунок с клонами на присутствие специфических антител методом непрямого твердофазного имму- поферментного анализа (ТИФА).

Клонирование положительных культур проводят методом предельных разведений, внося 0,5 клетки на 1 лунку 96-луночного плэйта с питающим слоем селезеночных клеток. Клон HMB-4F7 отобран как лучший продуцент монокло нальных антител и повторно клонирова по той же схеме, что и в первый раз. Один из реклонов, характеризующийся максимальной активностью и образованием асцитных опухолей у 100% привитых мышей BALB/C, назван ИМБ-4Р7.

Штамм клеток HMB-4F7 депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером BGKK(II) 35ID.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Суспензионная культура, состоящая из крупных округлых клеток с крупными ядрами и тонким ободком цитоплазмы. Ядрышки крупные, по 1-2 в ядре.

Культуральные признаки. Среда для культивирования - среда ДНЕМ: сыворо

o

S

0

5

,д

ка эмбриона коровы (10%), сыворотка новорожденных телят (10%), глютамин (2 ммоль), пируват натрия -(1 ммоль), 2-меркаптоэтанол (0,05 ммоль),. пени- цилин/стрептомицин (1000 ед/мл). Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия - встряхивание. Частота пассирования 2-3 раза в неделю. Посевная доза 150 тыс. клеток на 1 мл. Кратность рассева 5-10 раз.

Контроль контаминации. Бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.

Культура прививается и растет в виде асцита в перитонеальной полости мышей BALB/C. За 7 дней до введения клеток мышам-реципиентам вводят по 0,5 мл пристана. Асцит образуется через 10-15 сут после введения 1-5млн кле то к.

Продуктивность штамма. Первичная культура моноклональна. Проведено два клонирования. Все клоны позитивны. На протяжении 30 пассажей клона ИМБ-4Р7 интенсивность продукции антител не изменилась (титр антител по ELISA в культура/шной среде 10, а в асци- тической жидкости 3x10).

Мои AT принадлежат к иммуноглобулинам класса G10

Консервация клеток. Клетки ИМБ-4Р7 заморожены на 36-м пассаже. Общее количество ампул 20, по 4 млн клеток в ампуле. Криозащитная среда - ростовая среда с 50-60% эмбриональной телячьей сьюороткй и ТО% диметилсульфоксида. Выживаемость при размораживании 95%.

Пример,. Культивирование гибридомных клеток ИМБ-4Р7.

Во флаконы для культивирования клеток вносят гибридные клетки в концентрации 100-200 тыс. клеток в 1 мл среды ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной слчоротки коровы, 10% сыворотки новорожденных телят, 2 ммоль

40

45

50

55

глютамина, 1 ммоль пйрувата натрия, 0,05 ммоль 2-меркаптоэтанола и 1000 ед. пенициллин/стрептомицина. Клетки инкубируют 2-3 сут в стационарном состоянии при 37°С в атмосфере 6% СОа, Концентрация клеток, превышающая 1 млн в 1 мл, неблагоприятна для роста клеток и вызывает их гибель. Культуральную жидкость из флаконов с трехдневной культурой тестируют на присутствие Мон AT. При посеве клетки встряхивают, разбавляют ростовой средой до указанной концентрации и разливают по флаконам.

Приме р 2. Культивирование гибридомных клеток ИМБ-4Р7. . Клетки, растущие в культуральных флаконах, через 1-2 сут после пересева центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Клетки должны быть в концентрации, не превышающей 500 тыс/мл, т.е. находиться в логарифмической фазе роста. Клеточный осадок после центрифугирования ресуспендируют в определенном объеме культуральной среды без сыворотки и подсчитывают число жизнеспособных клеток с помощью трипаново- го синего. Доводят концентрацию клеток до 1-10 млн/мл и вводят в брюшную полость мышей BALB/C, предварительно обработанных пристанем. Обработку проводят однократно за 1-3 недели до введения гибридомных клеток путем инъекции 0,5 мл пристава. Через 1-3 недели (в зависимости от числа введенных клеток) образуются асцит- ные опухоли у 100% привитых мышей BALB/C. Количество асцитной жидкости, накапливающейся в брюшной полости мышей после введения им гибридомных клеток ИМБ-4Р7 (в среднем по 20 животным) , составляет 5 мл. Содержание Мон AT в 2 мл асцитной жидкости составляет 1 0-20 мг.

П р и м е р 3. Использование Мон AT ЙМБ-4Р7 в иммуноферментном анализе.

Для определения активности взаимо10

96-луночные пластины, сенсибил ванные РНК-полимеразой фага Т7 (2,5 мкг/мл белка, по 100 мкл вора на 1 лунку). Далее в лунк тин вносят по 100 мкл раствора тической жидкости в необходимо ведении в 10 мМ натрий-фосфатн фере, содержащем 150 мм NaCl, (ЗФР). Для снижения неспецифич взаимодействия в ЗФР добавляют 0,1% детергента Твин-20 и до 0 бычьего сывороточного альбумин Пластины инкубируют 1 ч при 37

J5 трижды промывают буфером ЗФР, жащем 0,05% детергента Твин-20 (ЗФР-Т).

После этого в лунки вносят 100 мкл коньюгата кроличьих ан

20 против иммуноглобулинов мыши с роксидазой хрена и инкубируют при 37°С. После шестикратной п ки ЗФР-Т в лунки вносят хромаг субстрат и 0,1%-ную Н202 в 0,5

25 цитратном буфере (рН 4,0). Опт плотность субстратной смеси в регистрируют при 405 нм с помо восьмиканального фотометра и о ют результаты.

Использование изобретения п ляет выявлять ДНК-зависимую РН меразу бактериофага Т7.

30

Формула изобрете Штамм гибридных культивируем

действия ИМБ-4Р7 с антигенными детер- клеток животных Mus musculus L

минантами ДНК-зависимой РНК-полимера- зы бактериофага Т7 применяют метод непрямого твердофазного анализа. В качестве твердой фазы используют

10

40157

96-луночные пластины, сенсибилизированные РНК-полимеразой фага Т7 (2,5 мкг/мл белка, по 100 мкл раствора на 1 лунку). Далее в лунки пластин вносят по 100 мкл раствора асци- тической жидкости в необходимом разведении в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 150 мм NaCl, pH 7,4 (ЗФР). Для снижения неспецифического взаимодействия в ЗФР добавляют до 0,1% детергента Твин-20 и до 0,2% бычьего сывороточного альбумина. Пластины инкубируют 1 ч при 37°С и

J5 трижды промывают буфером ЗФР, содержащем 0,05% детергента Твин-20 (ЗФР-Т).

После этого в лунки вносят по 100 мкл коньюгата кроличьих антител

20 против иммуноглобулинов мыши с пе- роксидазой хрена и инкубируют 1 ч при 37°С. После шестикратной промывки ЗФР-Т в лунки вносят хромагенный субстрат и 0,1%-ную Н202 в 0,5 м

25 цитратном буфере (рН 4,0). Оптическую плотность субстратной смеси в лунках регистрируют при 405 нм с помощью восьмиканального фотометра и оценивают результаты.

Использование изобретения позволяет выявлять ДНК-зависимую РНК-поли- меразу бактериофага Т7.

30

Формула изобретени Штамм гибридных культивируемых

BCKK(II) № 35ID, используемый для получения моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7.