Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

1 614 765

(13)

(51)

МПК

C12N15/28(2000-01-01)

(21) (22)

Заявка

3869300, 1985-03-05

(22)

дата подачи заявки

1985-03-05

(45)

опубликовано

1990-12-15

(72)

авторы

Масааки ЯмадаЯсуджи ФурутаниМицие НотакеЮнити Ямагиси

(73)

патентообладатели

Дайниппон Фармасьютикал Ко., Лтд

Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pHTN 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека Советский патент 1990 года по МПК C12N15/28

Описание патента на изобретение SU1614765A3

Изобретение относится к генетической .инженерии, в частности к конструированию рекомбинантной плазмидной ДНК,- кодирующей фактор некроза опухо- -ли человека.

Способ заключается в том, что конструируют ДНК плазмиды в результате культивирования человеческих макро- .фагов с индуктором, отделения фракции, содержащей и-РНК человеческого ФИО, от индуцированных клеток, получения одн-ДНК из л-РНК с использованием обратной транскриптазыс последующим привращением в дн-ДНК, введения дн-ДНК в вектор, трансформации рекомбинантным вектором организма хозяина и получения клонов, субклонирования к-ДНК, .кодирующей полйпептид человеческого ФНО или его главную часть из отобранных клонов и вьщеляют рекомбинантную плаз- миднуьэ ДНК, кодирующую человеческий ФНО.

Данные, 1гглюстрирующ1 е предлагаемый способ, приведены в табл. 1-1, 1-2, 2-1, 2-2, 3-10. : П р И м е р 1. Получают макрофап .:человекао Полученные макрофаги высевают в чашку с плотностью клеток, равной приблизит ельно от 2-10 до 1-10 клеток на 1 см и предварительно культивируют при 35 -38°С, предпочтительно при 37°С, в атмосфере 100%-ной. влаж- .; ности, содержащей 5% двуокиси углерода, в течение приблизительно от 30 мин до 2 ч.

Затем в качестве индуктора прибавляют эндотоксин, полученный из грам- отридательных бактерий, например лиOi

3 vl

Oi СП

пополисахарид, полученный из Escheri- cfiia coli; Pseudomonas aeruginosa или Salmonella tyhi, a в качестве ингибитора синтеза белка прибавляют цикло- гексимиДо Культивирование продолжают еще в течение 3-8 ч для накопления и-РНК человеческого ФИО в макрофагах. Количество эндотоксина, как правило, равно около 1-100 мкг/мл, В качестве индуктора можно дополнительно прибавить форболовый сложный эфир, такой как форбол-12-миристат-13-ацетат, форбол-12, 13-дидеканоат или форбол- -12,13-дибензоат в количестве прибли- зительно 1-2000 нг/мл. Количество ингибитора синтеза белка варьируется в зависимости от его типа,Например,в случае циклогексимвда оно равно J 0,1-50 мкг/мл, В качестве культураль- ной среды можно использовать различны культуральные среды, пригодные для культивирования клеток млекопитающих (RPMI-1640, МЕМ-среду Eagle и модификацию Dulbecco МЕМ-среды), В предпоч- тительном варианте в культуральную

среду прибавляют сыворотку животных ;(такую как эмбриональная бычья сыво- I ротка или сыворотка теленка) в количестве приблизительно 1-20%, ; После культивирования экстрагируют общую РНК из клеток, а затем аффинной колоночной хроматографией на олиго- (дТ)-7делл1олозе или поли(У)-сафарозе-- и отделяют фракцию, содержащую поля(А -и-РНК, Фракцию, обогащенную и-РНК ;человеческого ФИО, получают обработ- I кой фракции поли(А)-и-РНК электрофорезом на кислотно-мочевинном агароз- ном геле или центрифугированием в rpa диенте плотности са:;арозы.

Для подтверждения того, что получают фракцию и-РНК, кодирующую человеческий ФИО, и-РНК транслируют в белок и проверяют его биологическую актив- ность. Вводят и-РНК в ооциты Xenopus laevis и анализируют цитотоксической активностью in vitro по отношению к мьшшным клеткам L транслированного белка.

Пример 2, Поли(А).-н-РНК 1ШИ обогащенную и-РНК фракцию используют р качестве матрицы, а (дТ) - в качестве затравки д.пя синтеза одн-ДНК с использованием обратной транскрептазы (nanpiiMep, полученной из вируса птичьего миелобластоза в присутствии дАТФ, дПТД, дГТФ и дТТФ), Оид-ДНК используют в качестве матрицы и синтези

to J5 20 25

зО , Q

дс

p.sToT дн-ДНК с использованием обратной транскрептазы или ДНК-полимеразы Е,coli.

Результирующую дн-ДНК вводят в . плазмиду pBR 322, расщепленную Pst эндонуклеазой рестрикции. Результирующие рекомбинантные плазмиды вводят в клетку-хозяин, такую как E,coliXl776, получают набор клонов к-ДНК путем отбора колоний, устойчивых к тетрациклину.

Набор к-ДНК подвергают гибридизации с использованием Р-меченного фрагмента к-ДНК кроличьего ОНО, отбирают целевые клоны, содержащие реком- ешнантные плазмиды, имеющие к-ДНК- вставку, кодирующую полипептид человеческого ФНО,

Р-Меченную к-ДНК синтезируют с использованием фракции поли(А)-и-РНК или фракции, обогащенной и-РНК чело- . веческого ФНО, в качестве матрицы. Отдельно в качестве матрицы используют фракцию и-РНК, полученную по аналогичной методике, за исключением того, что в качестве сьфья используют неиндуцированные макрофаги и синтезируют Р-меченную к-ДНК, В качестве индуцирующей отрицательной пробы используют Р-меченную к-ДНК, Из указанного выше набора к-ДНК отбирают клоны плаз- мид, сильно гибридизующиеся с индукционной положительной пробой, но не гибридизующиеся с индукционной отрицательной пробой.

Описанную ниже операцию проводят для того, чтобы подтвердить то, что результирующие клоны содержат вставку к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФНО„ Плазмидную ДНК вьще- ляют из вьпиеуказанньсх клонов, превращают в однонитевую ДНК нагреванием или щелочной обработкой и фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах. Фракцию и-РНК, содержащую и-РНК человеческого ФНО, добавляют к фильтрам для гибридизации с помощью фиксированной ДНК, Выделенную и-РНК вводят в ооциты Xenopus laevis для определения того, кодирует ли вьщеленная и-РНК полипеп- тид человеческого ФНО,

Вышеуказанными способами получают трансформированные сисгемы, имеющие рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагмент ДНК, имеющий 1ггк;ледователь- ность оснований, ксь -ггик:м ; нтарную и-РНК человеческого .

Если полученные клонированные ДНК |Не содержат цельного участка, кодиру- ;ющего полипептид человеческого ФИО, то отбирают к-ДНК большего размера отбором из набора к-ДНК с использо- ванием в качестве пробы клонирован- ных ФНО-фрагментов к-ДНК из трансформированных систем

Клонированную к-ДНК, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность полипептида человеческого ФНО, анализируют путем определения последовательностей оснований некоторых фрагментов клонированной к-ДНК, обнаруживают последовательность оснований, гомологическую последовательность оснований к-ДНК кроличьего ФНО и отбирают те к-ДНК, которые

кается с ФИО кроличьей шшзмы. Это указьшает на то, что полная аминокис- последовательность полипептида человеческого ФНО не все гда необходима для экспрессии активности, частично модифидиро1занный полипептид человеческого фНО также обладает активностью, поскольку он содержит актив-,

0 НЬ1Й центр полного поли пептида ФНО,

II р и м е р 3. Модификацию ДНК проводят расщеплением ДНК подходящей эн- донуклеазной рестрикции и отщеплением одного или больше кодона подходящш- И

J5 экзрнуклеазами и/или эндонуклеазами, взятым11 индивидуально или в сочетании, с последующим замещением на дегенеративные или другие кодоиы, например на кодоны, синтезированные химически

содержат последовательность оснований, 20 по фосфотризфирному способу или отщеп- соответствующую цельному кодирующему участку для полипептида человеческого ФНО.

Гомологичность между последовательностью оснований, кодирующей кроличий ФНО, и последовательностью оснований, кодирующей полипептид человеческого ФНО, а также гомологичность между установленными аминокислотными последовательностями полипептида кроличьего ФНО и полипептида человеческого ФНО представлена, соответственно, в табл. 5 и 6.

Из этой гомологичности и из установленных N-концевых и С-концевых аминокислотных последовательностей кроличьего плазменного ФНО делают вы35

лением кодонов.

П р и м е р 4о Получение полипептида человеческого ФНО.

Плазмиду, кодирующую полипептид человеческого ФНО, получают введением клонированной к-ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО, в подходящий вектор. Можно использовать все векторы, пролиферирующие в трансфор- 30 мируемых микроорганизмах.

Плазмиду для получения неслитого полипептида конструируют связыванием фрагмента ДНК, содержащего последовательность оснований, кодирующую полипептид человеческого ФНО, где инициирующий кодон АТС прибавлен к з -окончанию и стоп-кодон (ТАА, TAG или TGA) имеется в 3 -конце, с фрагменвод о том, что К-ДНК человеческого ФИО кодирует полипептид-предшественник ФНО, содержащий 233 аминокислотных остатка, а сам полипептид человеческого ФНО представляет собой полипептид, соответствующий 155 аминокислотным остаткам от карбокси-окончания предшественника„

Наличие гомологичности последовательностей оснований и установленных аминокислотных последовательностей человеческого ФНО и кроличьего ФНО указывает на то, что они фшЮгенетически происходят из одного и того же гена, и свидетельствуют о том, что значительная часть- обычных участков представляет собой последовательность, необходимую для экспрессии биологической активности. Однако, как показано ниже, полный полипептид человеческого ФНО иммунологически не пересекается с ФИО кроличьей шшзмы. Это указьшает на то, что полная аминокис- последовательность полипептида человеческого ФНО не все гда необходима для экспрессии активности, частично модифидиро1занный полипептид человеческого фНО также обладает активностью, поскольку он содержит актив-,

НЬ1Й центр полного поли пептида ФНО,

экзрнуклеазами и/или эндонуклеазами, взятым11 индивидуально или в сочетании, с последующим замещением на дегенеративные или другие кодоиы, например на кодоны, синтезированные химически

по фосфотризфирному способу или отщеп-

лением кодонов.

П р и м е р 4о Получение полипептида человеческого ФНО.

Плазмиду для получения неслитого полипептида конструируют связыванием фрагмента ДНК, содержащего последовательность оснований, кодирующую полипептид человеческого ФНО, где инициирующий кодон АТС прибавлен к з -окончанию и стоп-кодон (ТАА, TAG или TGA) имеется в 3 -конце, с фрагментом ДНК, кодирующим промотор и последовательность Shine-Dalgarno. Плазмиду конструируют в результате введения фрагмента к-ДНК, имеющего последовательность ОСНОВАНИЙ, кодирующую

полипептид человеческого ФНО, где в 3 -конец добавлен обрывающий кодон, в вектор, в результате чего трансляционная считывающая структура соответствует структуре в структурном гене. Способ получения полипептида человеческого ФНО в форме слитого полипептиа имеет преимущество, вьфажающееся в сведении к минимуму разложения проукта в трансформированных клетках- хозяевах. Полный полипептид человечесого ФНО, соответствующий аминокислотой последовательности от серина в 2 положении до- лейцина в 236 полоуе- ии, в верхних строчках табл. 6, не со

держит метионина. Следовательно плаз- мида/ сконструированная введением фрагмента к-ДНК человеческого ФИО, связанного с 3 -окончанием дгоследова- тельности оснований структурного сливаемого гена через метиониновый кодон (АТС), позволяет человеческий ФИО в виде слитого продукта способом рас1чепления метиониновой пептидной связи, например обработкой бромцианом,Трансформированные организмы получают введением экспрессивного вектора в организм-хозяин,; -такой как (шкро- организм, например E.coli, После это- Го культивированием трансформированных организмов получают пЪлипептид человеческого ФИО или полипептид, со- держащ1-1й метионин в N-окончании. Продукт может накапливаться как в цитоплазме, так и Б периплазме клеток-хозяев в зависимости от способа конструирования экспрессивного вектора, Дпя TorOj чтобы вызвать вьщеление nojranen-25 тида в периплазме, конструируют плаз- миду с использованием гена, кодирующего секреторньй белок, такой как ген щелочной фосфатазы (phoA) или ген бел-.

ка, связьгоающего фосфат (phoS), в ре- 0 , аргинином, кофеином, П15окаином,

зультате связывания ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО,в правильной трансляционной считывающей структ фе с указанным выше геном в подходящем месте после участка ДНК, кодиругощего сигнальньш пептид.

Результирующие трансформированные организмы культивируют в подходящих условиях до полной выработки целевого полипептида. После этого полицептид экстрагируют из культ фы.После накоп- выработавшегося полипептида Е Ц - :топлазме клетки-хозяева подвергают разрушению обработкой лизоцимом, замораживанием и размораживанием или ультразвуковым диспергированием, либо с использованием пресса Френча, после чего центрифугируют или фильтруют и собирают экстракт,

Полученный таким образом полипептид о шщают обычными спогобами очист- ки белков, например сочетанием высалн- вания, ультрафильтрации, диализа, ион- нообмеиной хроматографии, гель-фильтрации, электрофореза, аффинной хроматографии и т,д.

Описанным выше способом получают полипептид человеческого ФНО по изоб35

хлористоводородной кислотой, глюконо-.- вой кислотой и т„п.

Модификацию полипептида человеческого ФНО или -его аллельного мутантного полипептида проводят по известным методикам,.

Химические и физико-химические свойства полипептида,

{олекулярньй вес,

Молекулярный вес рЧ-ФНО измеряют гель-фильтрационным анализом на колонке с Т 8К-гелем G 3000 SW в соответствии с жидкостной хроматографией высо-. кого давления, используя 0,2 И фосфатный (рН 7) буфер с или без 8 М мочевины и 0,5% 2-меркаптоэтанола в качестве растворителя, В качестве белков-маркеров молекулярного веса ис- пользуют бычий сывороточный альбумин. (MW 66000), кроличью триозефосфотизо- меразу (MW 53000), яичный альбумин (MW 45000), свиной пепсин (MW 32700), соевый i чгибитор трипсина (MW 20500), лошадиный миоглобин (MW 17800) и лошадиный цитохром-С (MW 12400),

В результате устанавливают, что рЧ-ФНО имеет молекулярный вес 45000± ±5000 и 18000+3000 дальтон соответст0

ретениго и/или полипептид с метионином на N-конце полипептида.

Пример 5, Под модифицированными полипептидами человеческого ФИО подразумевают полипептиды, полученные из аллельных мутантов ДНК кодиру- Ю1чей полипептид человеческого ФНО (ал- лельный мутантный полипептид), их получают в результате присоединения аминокислоты или пептида (состоящего из двух или более аминокислот) к N-OKOH- чанию или С-окончанию полипептида человеческого ФНО или аллельного мутант- ного полипептида, или в результате удаления одной или больше аминокислоты из полипептида человеческого ФНО, или аллельного мутантного полипептида (например, удаления 4 аминокислот из N-окончания по шпептида человеческого ФНО), а также прои:;водные, такие как сложные эфиры, ацильные производные или амиды кислот, образованные с использованием функциональной группы в молекуле, остатка амина в N-конце или -карбоксильного остатка в С-конце, и их соли, образованные аминоостатками или карбоксильными остатками, например с гидроокисью натрия,гидроокисью

хлористоводородной кислотой, глюконо-.- вой кислотой и т„п.

Химические и физико-химические свойства полипептида,

{олекулярньй вес,

В результате устанавливают, что рЧ-ФНО имеет молекулярный вес 45000± ±5000 и 18000+3000 дальтон соответственно в отсутствии и присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола,

к-ДНК, введенная в экспрессивную плазмиду pHTR 91, кодирует 155 амино- кислотных остатков (за исключением метионина, происходящего из инициирующего кодона АТС), Из установленной аминокислотной последовательности рассчитывают молекулярньй вес рЧ-ФНО JQ (17097 дальтон), Рассчитанный молекулярный вес согласуется со значением, определенным в присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола.

Этот факт указьшает на то, что 5 рЧ-ФНО присутствует в виде мономера (субъединицы) в присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола, но существует в виде агрегата, например в форме триме- ра, при отсутствии денатурирующих 20 агентов,

Изоэлектрическая точка,

Изоэлектрическую точку определяют гель-электрофорезом с изоэлектрофоку- сированием при 3 Вт в течение 3 ч с 25 использованием пластинки 5%-ного по- лиакриламидного геля;и градиента рН от 4,0 до 6,5,

Белок окрашивают Кумасси бриллиантовым голубым. Отдельно гель нарезают ЗО полосками 3 мм шириной и вымачивают В 20 мМ трис-НС1 (рН 7,8) буфере для элюирования белка. Цитотоксическую ктивность четко наблюдают в элюат.е з геля, вырезанного из места, соответствующего положению белка, опредеенному прокрашиванием.

Как бьшо установлено, изоэлектри- че ская точка рЧ-ФНО равна 5,9+0,3.

Аминокислотный состав 40

Аминокислотый состав рЧ-ФНО опрееляют с помощью аминокислотного микроанализатора флуорометрическим способом с использованием ортофталевого альдегида после гидролиза образца хло-д ристоводородной кислотой. /

50 мкг рЧ-ФНО гидролизуют в бн.НС при 11 . Аминокислотньй состав рас- считьшают с корректированием на основе значений, определенных в каждом об- п разце, гидролизованном 24,48 и 72 ч, Цистин и цистеин определяют в виде цистеиновой кислоты, превращенной с помощью окисления пероксимуравьиной ; кислотой. Триптофан определяют по флуорометрическому способу.

Результаты сведены в табл. 7.

Аминокислотньй состав хорошо согласуется с составом, рассчитанным из

последовательности оснований, кодиру- юпдих полипептид человеческого ФИО.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

N-Концевую аминокислотную последовательность рЧ-ФНО определяют по методике разложения Эдмана.

Фенилтиогид гнтоинаминокислоту, получающуюся из N-концевой аминокислоты в способе разложения по Эдману, идентифицируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с использованием колонки (4,6x250 мм) с TSK- гелем DDS 120А, Эти операции многократно воспроизводят для определения новых последовательно образующихся N-концевьгх аминокислот.

Обнаруживают последовательно, что N-концевая аминокислотная последовательность рЧ-ФНО является следующей;

NH -Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro- -Ser-Asp

Некоторые полипептиды, получаемые в микроорганизмах при применении технологии рекомбинантной ДНК, имеют в своих N-концах остаток метионина, получающийся из инициирующего кодона (АТС),

Определение С-концевой аминокислотной последовательности.

С-Концевую аминокислотную последовательность рЧ-ФНО определяют ферментативным способом с использованием карбоксипептидазо

рЧ-ФНО расщепляют карбоксипептида- дой-А и карбоксипептидазой Y при молярных соотношениях фермента ксубстра. ту равных соответственно 1 : 25 и 1 : 1000, Свободные аминокислоты, выделившиеся из С-окончания рЧ-ФНО в результате двойного отщепления, иденти- фицируют на аминокислотном микроана- :лизаторе через соответствующие интервалы времени от 2 до 180 мин после расщепленияо

Устанавливают, что С-концевая аминокислотная .последовательность рЧ-ФНО является следующей:

Tyr-Phe-Cly-Ile-Ile-Ala-Ieu-СООН,

Разложение рЧ-ФНО трипсином.

500 мкг рЧ-ФНО разлагают с помощью 20 мкг ТРСК-обработанного трипе при- комнатной температуре в течение 3 ч.

Разложенный продукт подвергают препаративному иэоэлектрофокусирующему гель-электрофорезу. Белки окрашивают Кумасси бриллиантовым голубым, В от- дельном опыте гель нарезают полосками шириной 3 мм и нарезан№1й гель вымачивают в 20 мМ трис-НС1 (рН ) буфере для элгоирования белка.

В результате устанавливают, что продукт разложения элюируемый из вырезанного геля, соответствующего зоне рН приблизительно на 0,3 более низкого, чем изоэлектрическая точка рЧ-ФНО обладает цитотоксической активностью.

В результате устанавливают, что частичная аминокислотная последовательность продукта разложения является следующей:

N-концевая: .JIHj -Thr-Pro-Ser-Asp-

С-концевая; --Ile-Ala-Leu-COOH.

Как показьшает аминокислотная последовательность, продукт разложения представляет собой полипептид, полу- чившшся в результате, отщепления четы рех К-коицевых аминокислот (Ser-Ser- -Ser-Arg) от рЧ-ФНО, и обладает указанной выше цитотоксической активностью. Это означает, что по крайней мере четыре N-концевые аминокислоты в не играют существенной роли в его биологической активности.

Биологическая активность.

Цитотоксическая активность по отношению к мышиной клетке L-Mo Образец (О,1 мл) серийно разводят указанной ниже средой и по Oj1 мл суспензии мышиных клеток L-M (100000 клеток на 1 мл) добавляют в каждую лунку многолуночной пластинки. Используют минимальную питательную , среду Eagle, содержащую 1% эмбриональной бычьей сьторотки. Пластинку инкубируют при ЗТ С в течение 8 ч Б пол 1ностью влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. После инкубирования прибавляют 20 мкл 25%-ного глyтapaльдeг щa для фиксирования жизнеспособных клеток. После фиксирова- -шя пластинку тгромывают и сушат. Пос- ле этого для окрашивания фиксирован- ных клеток прибавляют 0,1 мл 0,05%- ного раствора метиленового голубого. Избыток метиленового голубого отмываю и пластинки сушат. Метиленовый голу-

бой, связавпмйся с фиксированными клетками, элюируют 200 мкл 0,36 н. НС1 и измеряют его поглощение при 665 им. Поглощение пропорционально

Q 5

5 О

числу жизнеспособных клеток. Концентрацию биологической актив ности требующуюся для умерщвления 50% клеток L-M, определяют как 1 ед./мл. Цито- токсическую активность по отношению к клеткам L-M, определенную в указанных вьш1е условиях, выражают как единицы (LM) для того, чтобы отличать от цитотоксической активности по отношению к мьш1иным клеткам L-929 как клеткам-мишенямо

Определяют содержание белка„

В результате устанавливают, что рЧ-ФНО имеет удельную активность, равную 2-10 единиц (LM) и более на 1 мг белка.

Противоопухолевое действие на саркому Meth А, трансплантированную мышам о

Противоопухолевое действие на мышей с саркомой Meth А оценивают следукщим образом.

Машам BALB/C массой около 23 г внутрикожно трансплантируют 200000 -клеток саркомы Meth А в- кожу брюшины и через 7 дней отбирают мышей, у которых опухоль имела 6-7 мм в диаметре. На седьмой день после трансплантации опухоли рЧ-ФНО вводят в массу опухоли или внутривенно., Содержание эндотоксина в рецептуре рЧ-ФНО меньше, чем 0,01 нг на 1-10 единиц (LM) цитотоксической активности.

Устанавливают, что при введении в массу опухоли некроз опухолевого трансплантата наблюдается у всех мьтей, которым ввели рЧ-ФНО в дозах 110, 3-10 и1-10 единиц (LM) на мьш1ь в те- чание 24 ч после инъекции, и опухоль полностью регрессирует в размере 3/5, 5/5 и 5/5 соответственно при каждой указанной вьш1е дозе. При внутрчвен- ном введении некроз наблюдают у всех мьццей, получивших инъекцию рЧ-ФНО в дозе З Ю и 1-Ю единиц (LM) на мышь, и доля полной регрессии составляет соответственно 3/5 и 4/5.

Ингибиру яцее действие рЧ-ФНО на рост клеток опухоли человека in vitro. , Ингибирующее действие рЧ-ФНО на рост клеток опухоли человека и нор- мапьных клеток оценивают in vitro в следующих условиях. Клетки опухоли человека или нормальные клетки высеивают в количестве 10000 клеток на лунку R 1 мл минимальной питательной среды Eagle, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, с использованием пластинки с 24 лунками. Добавляют рЧ-ФНО в результирующей концентрации 1 OU единиц (ЬМ)/мл и затем культивируют при 37°С в течение 4 дней в полностью влажной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода. За 4 дня до окончания культивирования в каждую лунку прибавляют 1 мкл Н-тимидина. После культивирования клетки промыва- |п ют фосфатным солевым буфером и лизи- руют с помощью 0,5%-ного додецилсуль- фата натрия. Количество Н-тимидина, введенное в клетки, определяют, изме-. ряя радиоактивность лизата. 5

Ингибирующее действие в виде доли йнгибирования роста, рассчитьтаемой по следующему уравнению:

Доля йнгибирования роста (%) (а - Ь)(а -100), где а и b представило

ляют собой радиоактивность, введенную в клетки соответственно при отсутствии рЧ-ФНО и в гфисутствии рЧ-ФНО,

Результаты, сведенные в табл., 8, показывают, что рЧ-ФНО существенно ингибирует рост клеток опухоли человека, но не влияет на нормальные клетки. Это наблюдение показьшает, что рЧ-ФНО селективно атакует опухолевые клетки.

иммунологические свойства, Раствор рЧ-ФНО (100 единиц (ЬМ)/мп) смешивают с равным объемом разбавленного в 100 раз очищенного антитела против кроличьего ФИО. После инкубиг о- вания при 37°С в течение 2 ч измеряют цитотоксическую активность реакционной смеси.

Реферат патента 1990 года Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pHTN 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию рекомбинантной плазмидной ДНК PHT N 713, кодирующей фактор некроза опухоли. ДНК плазмиды конструируют в результате культивирования человеческих макрофагов с индуктором, отделения фракции, содержащей и-РНК человеческого ФНО, от индуцированных клеток, получения одн-ДНК из и-РНК с использованием обратной траскриптазы с последующим превращением в дн-ДНК, введения дн-ДНК PBR 322, трансформации рекомбинантным вектором организма-хозяина и получения клонов субклонирования к ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО или его главной части, из отобранных клонов выделяют рекомбинантную плазмидную РНК PHT N 713.

Формула изобретения SU 1 614 765 A3

Таблица -I-I

-ТСА GCT ТСТ CGG GCC СТО AGT GAC AAG СТА GCC САС СТА GTA GCA ААС CCG САА SAG GGC CAG СТС CAG TGG CTG AGC CAG

; .«

GCG ААС GCC CTG CTG GCC ААС GGC ATG СТС ACG GAC ААС CAG CTG GTG GTG CCG GAC GGG CTG ТАС СТС АТС ТАС ТСС CAG СТС ТТС AGC GGT САА GGC TGC CGC ТСС GTG СТС СТС ACT САС ACT GTC AGC CGC GCC GTC ТСС ТАС CCG ААС AAG GTC ААС СТС ТСТ GCC АТС AAG AGC ССС TGC САС GAG АСС ССС GAG GAG GCT GAG ССС ATG TGG ТAC GAG CCC АТС ТАС CTG GGC GGC TTC C7iG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC ACC GAG GTC AAC CAG CCT GAG TAC CTG CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TTT АТС ATT GCC CTG-(3)

Табжца 1-2

Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys Pro Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Val Gly Gin Leu Gin Trp Leu Ser Gin Arg Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Het Lys Thr Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ala Gly Leu Tyr Leu lie Tyr Ser Gin Val

5161476516

. Продолжение табл1тцы 1

Leu Phe Ser Gly Gin Gly Cys Arg Ser Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe Ala Val Set Tyr Pro Asn Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys Ser Pro Cys His Arg Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly, Gly Val Phe Gin Leu Gla Lys Gly Asp Arg Leu Ser Thr Glu Val Asn Gin Pro Glu Tyr Leu Asp Leu Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly He He Ala Leu

Таблица 2-1

(5)-AGC ACT GAG AGT АТС АТС CGG GAC GTC GAG CTG GCG GAG GGG CCG CTC CCC AAG AAG GCA GQG GGG CCC CAG GGC TCC AAG CGC TGC CTC TGC CTC AGC CTC TTC TCT TTC CTG CTC GTG GCT GGA .GCC ACC ACG CTC TTC TGC CTG CAC TTC AGG GTG АТС GGC CCT C.AG GAG G/VA GAG CAG TCC CCA AAC AAC CTC CAT СТА GTC AAC CCT GTG GCC CAG ATG GTC ACC CTC AGA TCA GCT TCT CGG GCC CTG AGT GAC AAG CCT СТА GCC CAC GTA GTA GCA AAC CCG CAA GTG GAG GGC CAG CTC CAG TGG CTG AGC CAG CGT GCG AAC GCC CTG CTG GCC AAC GGC ATG AAG CTC ACG GAC AAC CAG CTG GTG GTG CCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC АТС TAC TCC CAG GTT CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC TAC GTG CTC CTC ACT CAC ACT GTC AGC CGC TTC GCC GTC TCC TAC CCG AAC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC АТС AAG AGC CCC TGC CAC CGG GAG ACC CCC GAG GAG GCT GAG CCC ATG GCC TGG TAC GAG CCC АТС TAC.CTG GGC GGC GTC TTC CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC AGC ACC GAG GTC AAC CAG CCT GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TTT GGG АТС ATT GCC CTG-(34

1614763 и

..Табжца 2-2

Thr Glu Ser MetHeArgAsp Val Glu

Ala Glu Gly ProLeuProLys Lys Ala

Gly Pro Gin GlySerLysArg Cys Leu

Leu Ser Leu PheSerPheLeu Leu Val

Gly Ala Thr ThrLeuPheCys Leu Leu

Phe Arg Val HeGlyProGin Glu Glu

Gin Ser Pro AsnAsnLeuHis Leu Val

Pro Val Ala GinMetValThr Leu Arg

Ala Ser Arg AlaLeuSerAsp Lys Pro

Ala His Val ValAlaAsnPro Gin Val

Gly Gin Leu GinTrpLeuSer Gin Arg

Asn. Ala Leu LeuAlaAsnGly Met Lys

Thr Asp Asn GinLeuValVal Pro Ala

Gly Leu Tyr LeuHeTyrSer Gin Val

Phe Ser Gly GinGlyCysArg Ser Tyr

Leu Leu Thr HisThrValSer Arg Phe

Val Ser Tyr ProAsnLysVal Asn Leu

Ser Ala He LysSerProCys His Airg

Thr Pro Glu GluAlaGluPro Met Ala

Tyr Glu Pro HeTyrLeuGly Gly Val

Gin Leu Glu LysGlyAsp Arg Leu Ser

Glu Va.l Asn GinProGluTyr Leu Asp

Ala Glu Ser GlyGinValTyr Phe Gly , He Ala Leu

10 20 30

GGGGGGGGGGGGGGGCCCTCTGGAGAGAGCGdCATGAGCACTGAGAGTATGATCCGGGAC

CCCCCCCCCCCCCCCGGGAGACCTCTCTlCGCGGTACTCG GACTCTCATACTAGGCCCTG

70 80 90 100 110 120

GTCGAGCTGGCGGAGGGGCCGCTCCCCAAGAAGGCAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAAGCGCJ CAGCTCGACCGCCTCCCCGGCGAGGGGTTCTTCCGTCCCCCCGGGGTCCCGAGGTtiCGCG

. .« ч ,

Haell 130 140 150 160 170. 180

TGCCTCTGCCTCAGCCTCTTCTCTTTCCTGCTCGTGGCTGGAGCCACCACGCTCTTCTGC ACGGAGACGGAGTCGGAGAAGAGAAAGGACGAGCACCGACCTCGGTGGTGCGAGAAGACG

, Еабдаца.

Haell 40 50 60

1 0200210220230240

CTGCTGCACTTCAGGGTGATCG.GCCCTCAGGAGGAAGAGCAGTCCCCAAACAACCTCCAT GACGACGTGAAGTCCCACTAGCCGGGAGTCCTCCTTCTCGTCAGGGGTTTGTTGGAGGTA

250 260270280 |AvaI2-90300

STftSTHfi;i5SSTSTS5SES ™ TCAcicTCAGATCAGCTT4cGGGCCCTGAGTGAC

:GGGACTCACTG

GATCAGTTGGGACACCGGGTCTACCAGTGGGAGTCTAGTCGAAGAGCC

310 . 320 330 340 350 360

SSSSS C GTGGAGGGCCAGCTCCAGTGGCTGAGC TTCGGAGATCGGGTGCATCATCGTTTGGGCGTTCACCTCCCGGTCGAGGTCACCGACTCG

370 380 390 400 410 420

CAGCGTGCGAACGCCCTGCTGGCCAACGGCATGAAGCTCACGGACAACCAGCTGGTGGTG GTCGCACGGTTGGGGGACGACCGGTTGCCGTACTTCGAGTGCCTGTTGGTCGACCACCAC

430 440 450 460 470 . 480

CCGGCCGACGGGCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTTCTCTTCAGCGGTCAAGGCTGCCGC GGGCGGCTGCCCGACATGGAGTAGATGAGGGTCCAAGAGAAGTCGCCAGTTCCGACGGCG

490 500 510 520 530 540

TSSTiSS T CGCTTCGCCGtCTCCTACCCGAACAAGGTC AGGATGCACGAGGAGTGAGTGTGACAGTCGGCGAAGCGGCAGAGGATGGGCTTGTTCCAG

550 560 570 580 , 590 600

f SSSTSSr CC GACCclcCGAGGAGGCTGAGCCC iTGGAGGAGAGACGGTAGTTCTCGGGGACGGTGGCCCTCTGGGGGCljCCTCCGACTCGGG

610 620 . 630 640

Aval

650 660

..I t -x/- J J

ATGGCCTGGTACGAGCCCATCTACCTGGGCGGCGTCTTCCAGTTGGAGAAGGGTGACCGG TACCGGACCATGCTCGGGTAGATGGACCCGCCGCAGAAGGTCAACCTCTTCCCACTGGCC

, 680 690 700 710 720

CTCAGCACCGAGGTCAACCAGCCTGAGTACCTGGACCTTGCCGAGTCCGGGCAGGTCTAG GAGTCGTGGCTCCAGTTGGTCGGACTCATGGACCTGGAACGGCTqAGGCCCGTCCAGATG

730 740 750 . 760 770 780

TTTGGGATCATTGCCCTGTGAGGGGACTGACCACCACTCCTCCCCCTCTGCCACCCCAGC AAACCCTAGTAACGGGACACTCCCCTGACTGGTGGTGAGGAGGGGGAGAGGGTGGGGTCG

790 800

CCCCTCACTCTGGGCGCCCTCAG GGGGAGTGAGACCCGCGGGAGTC

Продолжение табл.3

:GGGACTCACTG

Aval

650 660

t -x/- J J

1614765

Таблица

GACCCACGG

-30-20-10-1

СТССАСССТСТСТССССТООЛЛЛССАСАСС

1 10 20 . ЗО I I I I

ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTG HetSerThrGluSerKetlleArgAspVal

40 50 60

GAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAG GluLeuAlaGluGluAlaLeuProLysLys

70 80 90

ACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGC ThrGlyGlyProGlnGlySerArgArgCys

100 110 120

TTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATC LeuPheLeuSerLeuPheSerPheLeuIle

130 140 150

GTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTG ValAlaGlyAlaThrThrLeuPheCysLeu

160 170 180

CTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGG LeuHisPheGlyVallleGlyProGlnArg

190 200 210 I I t

GAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATC GliiGluPheProArgAspLeuSerLeuIle

220 230 240

AGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGApCATCT SerProLeuAlaGlnAlaValArgSerSer

250 260 270

TCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCC SerArgThrProSerAspLysProValAla

280 290 300

CATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGG HisValValAlaAsnProGlnAlaGluGly

310 320 330

CAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAAT GlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsn

340 350 360

GCCCTCCTGGGCAATGGCGTGGAGCTGAGA AlaLeuLeuAlaAsnGlyVaXGluLeuArg

231614765

Продолжение та

370380390

GATAACGAGCTGGTGGTGCCATCAG/ GGGC AspAsnGlnLeuValValProSerGltiGly

400 410 420

CTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC LeQTryLeuIleTyrSerGlnValLeuPhe

430 440 450

AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTG LysGlyGlnGlyCysProSerThrHisVal

460 470 480

CTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCC LeuLeuThrHisThrlleSerArglleAla

490 500 510

GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTC ValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeu

520 530 540

TCTGCCATCAAGAGCCCCTCCCAGAGGGAG SerAlalleLysSerProCysGlnArgGlu

550 560 570

ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGG ThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrp

580 590 600

TATGAGCCCATGTATCTGGGAGGGGTCTTC TyrGluProIleTyrLeuGlyGlyValPhe

610 620 . 630

CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCT GlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAla

640 650 660

GAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTT GlullcAsnArgProAspTyrLeuAspPhe.

670 680 690

GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATC AlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlylle

700 710 720

ATTGCCCTGfrGAGGAGGACGAACATCCAAC lleAlaLo j)

730740

CTTCCCAAACGCCTCCCCTGC

WGAGCACTG/i ЛТСЛССАСТО

GAGCTGGCCGAGG .VqGpGCTCCCCAAGAAG

;AGCTGGCGGAGG

:GCTCCCCAAGAAG

bfflllCCTCAGCCTCTTCT

:CTCAGCCTCTTCTCritrTCCTGldrC

150

GTGGd C

GTGG

CyGCACTT CTGCACTT

.GAAGAqШ1ССС

GAAGACSCAGfflGCCC

ДГСЙСЮСС СГСДЙССС

qrGGCCCAGj(

GJTGGCCCAGJ TGGTCJ

AGATCA AGATCJ

ft ТУ Ф ГР РГГЗД Д

ri «LN JL X 4 J. v v:arVr

У гртогг1Л тл Л Л. J. i. С X CUvjVj

CTTCTCG{G(

ClpAGGQGCAGCTCC

jAGGQC CAGCTCCAGTGGCTGAGbgAG

GA KG

ЗЛТ ACCAGCTGGTGGTGCdA 3AC ACCAGCTGGTGGTGCC

Таблица 5

Qq TGЛTCCGGGACG IG GIV TGATCCGGGACG1C

:GCTCCCCAAGAAG

TTCCT

CritrTCCT

3CCACCACGCTCTTCTGCCTG 3CCACCACGCTCTTCTGCCTG

;TGATCGGCCCCpAGlAi

;TGATCGGCCC IICAGJG

CCCOGAGTGACAAG :CCI|GAGTGACAAG

ITAGCAAACCdTCAA TAGCAAACCCKCAA

G CCTCTTCAlAq G JT

::TCTTC/feriG(3ccAAGGCTGcqcjc стсттсл)афф рдАосстссф|с

АСССЙГ

GTGCTCCTCACCpACAQCATCAGC

fnf f y-J-rJj i V 4 « .ГЧ -« - „

TGCTCCTCAQllCACACTGTCAGC

CGqApCGCCGTCTCCTACq fel

CGqrlrcGCCGTCTCCTAca:b/

540

ACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTG C AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC

570

CWGA

GGAGACCCCJb GGGGGCTGAQG

CAiCфGGAGACCCqqЗAGGAGGCTGAGф

600

JQCCTGGTA TCA GCCCATCTA/TCTGGdA .fifllqG{CCTGGT/j AGCCCATCTA|qCTG C

630

FjiJ

TCTTCCAGOTGGAGAAGGGTGACCGA iTCTTCCAGJIJTCGAGAAGGGTGACCGJG

660

:TCAGCP :rcAG

SAOTfTTGCCGAGTOTlGGGCAGGTCTAC i 4S15CCGAGT CJGGGCAGGTCTA,C

TTTGGGATCATTGCCCTGTGA TTTGGGATCATTGCCCTGTGA

Примечание. Верхние строчки; последовательность оснований,

кодирующая человеческий ФНО- 1предшественник.

Нижтое-строчки: последовательность оснований, кодирующая кроличий ФНО-пред- шествеьник.

Области, заключенные в прямоугольник, являются

гомологичным участком.

Обозначение показывает удаление кодона.

Обозначение ххх показывает обрывающий кодон.

1614765

Прололжение табл.5

420

510

:AAGGTC :AAGGTC

Met Ser The Glu Ser 5йt He Ser Thr GIU Ser Met He

Leu Leu

Ala Ala

Glu Glu

Thr Ala

Gly Gly Pro Gin Gly Ser Gly Gly Pro Gin Gly Ser

Phe Cys

eu Ser Leu Phe Ser eu Ser Leu Phe Ser

Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu

Gl Glu

Gin

Phe Ser

He Ser Val Asn

Arg Ser Ser

Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Arg Ala Asn Ala Leu Lou Ala Asn Gly

sp Asn Gin Leu sp Asn Gin Leu

1614765

Таблица б 10

Arg Asp Val Arg Asp Val

Glu Ala Gly Pro

Leu Pro Lys Lys .eu Pro Ly.s Lys

Arg Lys

Лгд Cys rg Cys

Phe Leuj He Phe Leg leu

Arg Asp

Asn Asn

Leii Ser Led His

LeiP Leu

Ala

Val Thr

Val Leu

Thr Pro Ala Leu

Ser Asp Lys Ser Asp Lys

110

Asn Arg Ser Gin

120

Val Met

130

Val Proj Val Val Pro

предшественник человеческого ФИО, Нижние строчки: предшественник кроличьего ФИО. Участки, обведенные прямоугольником, являются гомологичным участком. Обозначение показывает удаление аминокислоты.

16i4765. |2

Продолжение табл.6

140

мочевого пузыря 1 (АТСС CRL 1500) карцинома

молочной железы (АТСС CRL 1543) остеогенная саркома (АТСС CCL 218) аденокарци.нома толстой кишки (АТСС НТВ 22) аденокарцинома молочной железы (АТСС CRL 1440) почечная

лейомибластома 1 (АТСС CRL 1469) эпителоидная карцинома (АТСС CCL 2) эпителоидная

карцинома

161А765

Таблица

Таблица 8

49 97 47 37 69 98 59 31

1614765

Таблица

10 20 30 GGGGGGGGGGGGGGGCCCTCTGGAGAGAGC 40 50 60

GCCATGAGCACTGAGAGTATGATCCGGGAC MetSerThrGluSerHetlleArgAsp

70 80 90 I I I

GTCGAGCTGGCGGAGGGGCCGCTCCCCAAG ValGluLeuAlaGluGlyProLeuProLys100 110 120 I I (

AAGGCAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAAGCGC LysAlaGlyGlyProGlnGlySerLysArg

130 140 150 t I I

TGCCTCTGCCTCAGCCTCTTCTCTTTCCTG CysLeuCysLeuSerLeuPheSerPheLeu

160 170 180

CTCGTGGCTGGAGCCACCACGCTCTTCTGC LeuValAlaGlyAlaThrThrLeuPheCys

190 200 210

CTGCTGCACTTCAGGGTGATCGGCCCTCAG LeuLeuHisPheArgVallleGlyProGln

220 230 240

GAGGAAGAGCAGTCCCCAAACAACCTCCAT GlUGluGluGlnSerProAsnAsnLeuHis

250 260 270

CTAGTCAACCCTGTGGCCCAGATGGTCACC LeuValAsnProValAlaGlnMetValThr

280 290 300

CTCAGATCAGCTTCTCGGGCCCTGAGTGAC LeuArgSerAlaSerArgAlaLeuSerAsp

310 320 330

AAGCCTCTAGCCCACGTAGTAGCAAACCCG LysProLeuAlaHisValValAlaAsn Pro

340 350 360

CAAGTGGAGGGCCAGCTCCAGTGGCTGAGC GlnValGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuSer

370 380 390

CAGCGTGCGAACGCCCTGCTGGCCAACGGC GlnArgAlaAsnAlaLeuLcuAlaAsnGly

I61A76538

iIIKlЛ(:I,кeниe табл.9

400 410 420 I t

ATGAAGCTCACGGACAACCAGCTGGTGGTG MetLysLeuThrAspAsnGinLeuValVal

430 440 450

CCOGCCGACGGGCTGTACCTCATCTACTCC ProAlaAspGlyLeuTyrLeuIleTytSer

460 470 480

CAGGTTCTCTTCAGCGGTCAAGGCTGCCGC GlnValLeuPheSerGlyGlnGlyCysArg

490 500 510

I TCCTACGTGCTCCTCACTCACACTGTCAGC SerTyrValLeuLeuThrHisThrValSer

520 530 540 t t

CGCTTCGCCGTGTGCTACCCGAACAAGGTC ArgPheAlaValSerTyrProAsnLysVal

550 560 570 I I I

AACCTCCTCTCTGGCATCAAGAGCCCCTGG AsnLeuLeuSerAlalleLysSerProCys

580 590 600

CACCGGGAGACCGCCGAGGAGGCTGAGCCC TiisArgGluThrProGluGluAlaGluPro

610 620 630 I II

ATGGCCTGGTACGAGGCCATCTACGTGGGC MetAlaTrpTyrGluProIleTyrLeuGly.

640 650 660

GGCGTCTTCCAGTTGGAGAAGGGTGACCGG GlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArg

670 680 . 690

CTCAGCACCGAGGTCAACCAGCCTGAGTAC LeuSerThrGluValAsnGlnProGluTyr

700 710 720

CTGGACCTTGCCGAGTCCGGGCAGGTCTAC LeuAspLeuAlaGluSerGlyGlnValTyr

730 740 750

TTTGGGATCATTGCCCTGTGAGGGGACTGA PhcGlyllelleAlaLeu

760 770 780 CCACCACTCCTCCCCCTCTCCCACCCCAGC

790 800 CCCCTCACTCTGGGCGCGCTCAG

Получение и-РНК ФИО из человеческих альвеолярных макрофагов.

Человеческие альвеолярные макрофаги собирают бронхо-альвеолярным промыванием с помощью фосфатного солевого буфера. Альвеолярные макрофаги, 6,3-10 клеток, суспендируют в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональ- ной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 см) при концентрации клеток клеток на чашку. Их предварительно культивируют при 37 С в полностью влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, Через 1 ч культивирования эндотоксин (липополисахарид, полученный из E.coli), ТРА (форбол-12-миристат-13- -ацетат) и циклогексимид (ингибитор синтеза белка) добавляют в чашки та- киК образом, чтобы их результирующие концентрации стали равны 10 мкг/мл, 10; нг/мл и 1 мкг/мл соответственно. После этого культивирование продолжают проводить еще в течение 4-4,5 ч (общее время 5-5,4 ч). Культуральную среду удаляют отсасыванием, и макрофаги, адгезированные к чашкам, лизи- pyjoT и гомогенизируют в 5 М гуанидил- тиЬцианатном растворе, содержащем 0,6% Ы-лауроилсаркозината натрия и 6 мМ 1щтрата натрия. Гомогенизат заг- py;kaK T в 5,7 М раствор хлорида цезия, содержащий 0,1 М ЭДТУК, -и центрифугируют в течение 20 ч при 26500 об/мин с использованием ультрацептрифуги с получением общей фракции РНК в форме гранул. Гранулы растворяют в небольшом количестве 7 М раствора мочевины, содержащего 0,35 М NaCl, 20 мМ трйс-НС (рИ 7,4) и 20 мМ ЭДТУК, и выделяют осаждением из этанола. Получаю 159 хасг общей РНК,

Фракцию общей РНК растворяют в 1 14Л Ю гЖ трис-HCl (рН 7,4), буфера., содержащего 1 мМ ЭДТУК (обозначается как ТЗ-раствор), и раствор нагревают при в течение 5 мин. Добавляют раствор хлористого натрия до результирующей концентрации 0,5 М, и раствор наносят на колонку с олиго(лТ)-целлюравновесное состояние по отношению к ТЭ-раствору, содержащему 0,5 М хлорис6 мкг поли(А)-и-РНК растворяют 40 мкл буфгра 50 мМ трис-НС (рН8, содержащего 10 мМ MgClg, 10 мМ дит

тый натрий, Поли(А)-и-РНК элюируют из 55 треитола, 4 мМ пирофосфата натрия.

колонки с помощью ТЭ-раствора и полу- чагот 8 М1СГ „

Поли(А)-и-РНК растворяют в концентрации 1,-9 нг/нл в дистиллирован1,25 мМ каждого из трех дезоксириб нуклеотидтрифосфатов, дГТФ, дАТФ и дТТФ, 0,5 мМ дЦТФ, 167 нМ альфа-дЦТФ (удельная радиоактивность

ной воде и раствор инъектируют в ооци- ты Xenopus laevis в дозе приблизительно. 50 нл на оои;ит способом микроинъекции. Десять ооцитов инкубируют в 100 мкл среды Barth при 22°С в течение 24 ч. Ооциты гомогенизируют и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант подвергают анализу на ФИО-активность определением ци- тотоксической активности по отношекгю к клеткам : L-929 мыши.

Способ измерения цитотоксической активности по отношению к клеткам

L-929 является следующим.

Образец (О,1 мл) серийно разбавляют указанной ниже средой и в каждую лунку пластинки с 96 лунками прибавляют О,1 мл суспензии клеток L-929

( клеток/мл), содержащей актино- мицин D (2 мкг/мл). Используют минимальную питательную среду Eagle, содержащую 1% эмбриональной бычьей сыворотки. Пластинку инкубируют при

38,5°С в течение 18 ч в полностью . влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа,

Методики определения числа жизне- способных клеток L-929 и оценки биологической активности являются такими же, как методики анализа на цитотокси- ческую активность с использованием . клеток L-M в качестве клеток-мишеней, Цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-929, определенную в указанных выше условиях, выражают как единицы (L-929) дпя того, чтобы отличать ее от цитотоксической активности по отношению к мышиным клеткам L-M,

Супернатант, полученньй так, как описано выше, обладает цитотоксичас- кой активностью 6,6 единиц (L-929) на 1 мл. Это указьюает на то, что образец поли(А)-и-РНК содержит и-РНК ФИО,

Синтез к-ДНК,

Комплементарную ДНК синтезируют с 50 использованием полученной поли(А)-и- -РИК в качестве матрицы,

6 мкг поли(А)-и-РНК растворяют в 40 мкл буфгра 50 мМ трис-НС (рН8,3), содержащего 10 мМ MgClg, 10 мМ дитио5 треитола, 4 мМ пирофосфата натрия.

треитола, 4 мМ пирофосфата натрия.

1,25 мМ каждого из трех дезоксирибо- нуклеотидтрифосфатов, дГТФ, дАТФ и дТТФ, 0,5 мМ дЦТФ, 167 нМ альфа Р- -дЦТФ (удельная радиоактивность

3000 Ci (NtMonb), - 4 мкг олиго (дТ) и 120 единиц обратной транскрнптазы, полученной из врфуса птичьего миело- бластоза птиц (ВШ-i), и инкубируют при 43 С в течение 30 мин. После этого реакцию останавливают прибавлением ЭДТУК. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол - хлороформ (1:1) и к водной фазе прибавляют ацетат аммония до результирующей концентрации 2,5 М. Результирующий гибрид к-ДНК-и- -РНК выделяют из водной фазы осаждением из этанола Осадок гибрида к-ДНКри-РНК растворяют в 10 мкл 20 мМ буфе-15 динения к окончанию дкк-ДНК (за исра трис-НС1 (рН 7,5), содержащего 5 Mf

MgClj, 10 мМ сульфата аммония, 100 мМ

хлористого калия, 0,15 мМ бетаникотинамидаденйндинуклеотида, 5 мкг

бычьего сывороточного альбумина,

0,04 мМ каждого из четырех дезоксирибон5пслеотидтрифосфатов, дГГФ, дАТФ,

дТТФ и дЦТФ, 0,9 ед, рибонуклеазы Н.

;Е. со11 и 23 ед. ДНК-полимеразы I,

ключением того, что он содержит 80 единиц терминальной дезоксинуклеоти- дилтрансферазы и Н-дГТФ вместо Р-дЦТФ) и инкубируют при 374 в те 20 чение 20 мин, осуществляя присоедине ние приблизительно 10-15 остатков де зоаксигуанидиновой кислоты (дГ) к 3 -окончаниям. Реакционную смесь экс р агируют смесью фенол -хлороформ и ДН

|Е, coli, и инкубируют при 12 С в тече-25 pBR 322, оканчивающуюся олиго(дГ),

ние 60 мин, а затем еще в течение 60 мин при 22°С для синтеза дик-ДНК. Реакцию останавливают прибавлением ЭДТУК, ДНК-ДНК экстрагируют смесью фенол - хлороформ и выделяют осаждением 30 из этанола.

Получение к-ДНК с олиго(дЦ)-окончанием

ДНК-ДНК растворяют в 100 мкл 100 мМ буферного раствора какодилата натрия (рН 7,2), содержащего 2 мМ СоС1д, 0,2 мМ дитиотреитола, 0,1 мМ альфа- Р-дЦТФ (удельная радиоактивность 3 Ci (ммоль) и 10 единиц терминальной дезоксинуклеотидилтрансфера- 40 зы, и инкубируют при в течение 30 мин для достижения присоединения окончаний олиго (дЦ) к 3-окончаниям ДНК-ДНК,

Реакцию останавливают прибавлением 45 ЭДТУК ДНК-ДНК,оканчивающуюся олиго(дЦ) ,

экстрагируют смесью фенол - хлороформ и выделяют осаждением из этанола ДНК-ДНК,оканчивающуюся олиго(дЦ),

растворяют в 10 мМ буфере трис-НС1 50 СрН 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТУК и 100 мМ хлористьм натрий, с получением результирующей концентрации днк-ДНК, оканчивающейся олиго(дЦ), равной 2 мкг на 1 мл

выделяют из водной фазы осаждением этанолом. Результирующую ДНК pBR 322 с присоединенными окончаниями раство ряют в том же буфере, какой был использован для растворения олиго(дЦ)- концевой ДНК-ДНК таким образом, чтоб результирующая концентрация ДНК pBR 322 с присоединенными окончаниями бы ла равна 20 мкг/мл.

Конструирование рекомбинантных плазмид,

120 мкл раствора олиго(дЦ)-концевой к-ДНК смешивают с равным объемом раствора олиго (дГ)-концевойДНК pBR32 и смесь инкубируют последовательно при 65 °С в течение 5 ют и при 57 с в течение 120 мин для достижения ренатурации и конструирования рекомбинантных плазмид.

Отбор организмов-хозяев,

С помощью полученных выше рекомби нантных плазмид трансформируют штамм E.coli X 1776.

E,coli X 1766 культивируют при 37°С в 20 МП Ь-бульоиа (состав: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого натрия

и 1 г глюкозы

на 1 л; рН 7,2),содержащего 100 мкг/м диаминопимелиновой кислоты и 40 мкг/мл тимилина, до тех пор, пока мутность, измеряемая при 600 им, не достигнет 0,5. Ктетки собирают центрифугированием при , гфомыпают 10 мл- 10 мМ буфера трис-ИС1 (рН 7,3), содержащег

Получение ДНК pBR 322, оканчивающейся олиго (дГ) .

10 мкг ДНК pBR 322 растворяют в 100 мкл 20 MiM буфера трис-НС1 (рН

7,4), содержащего 10 мМ хлористсгс магния, 50 мМ сульфата аммония и ; 10 кг бычьего сывороточного альбумина, и прибавляют 15 рестрикць- онной эндонуклеазы Pst I, Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После окончания реакции реакционную смесь экстрагируют смесью фенол - хлороформ и результирующую ДНК выделяют из водной фазы осаждением из этанола, Полученную ДНК растворяют в 200 мкл такого же буферного раствора, кото- рьй был использован выше, для присоединения к окончанию дкк-ДНК (за исключением того, что он содержит 80 единиц терминальной дезоксинуклеоти- дилтрансферазы и Н-дГТФ вместо Р-дЦТФ) и инкубируют при 374 в те- чение 20 мин, осуществляя присоединение приблизительно 10-15 остатков де- зоаксигуанидиновой кислоты (дГ) к 3 -окончаниям. Реакционную смесь экст- р агируют смесью фенол -хлороформ и ДНКpBR 322, оканчивающуюся олиго(дГ),

выделяют из водной фазы осаждением этанолом. Результирующую ДНК pBR 322 с присоединенными окончаниями растворяют в том же буфере, какой был использован для растворения олиго(дЦ)- концевой ДНК-ДНК таким образом, чтобы результирующая концентрация ДНК pBR 322 с присоединенными окончаниями была равна 20 мкг/мл.

Конструирование рекомбинантных плазмид,

120 мкл раствора олиго(дЦ)-концевой к-ДНК смешивают с равным объемом раствора олиго (дГ)-концевойДНК pBR322 и смесь инкубируют последовательно при 65 °С в течение 5 ют и при 57 с в течение 120 мин для достижения ренатурации и конструирования рекомбинантных плазмид.

Отбор организмов-хозяев,

С помощью полученных выше рекомбинантных плазмид трансформируют штамм E.coli X 1776.

и 1 г глюкозы

на 1 л; рН 7,2),содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты и 40 мкг/мл тимилина, до тех пор, пока мутность, измеряемая при 600 им, не достигнет . 0,5. Ктетки собирают центрифугированием при , гфомыпают 10 мл- 10 мМ буфера трис-ИС1 (рН 7,3), содержащего

50 мМ хлористый кальций. Клетки снова суспеьщируют в 2 мл того же буферного раствора и оставляют стоять при в течение 5 мин К 0,2 мл суспензии прибавляют О,1 мл раствора рекомби- нантных плазмид. Смесь оставляют стоять при в течение 15 NOTH и затем вьщерживают при 42°С в течение 2 мян, Затем гфибавляют 0,5 мл L-бульона с добавками, проводят культивирование при встряхивании в течение 1 ч. Отбирают аликвоту культуры, наносят на пластинку агара с L-бульоном, содержащим добавки, содержащую тетрациклин в концентрации 15 мкгУмп, и культивиру- ют при ЗУс в течение приблизительно 12 ч. Набор к-ДПК получают отбором трансформированных клеток, устойчивых к-тетрациклину,

Клонирование к-ДИК человеческого ФНОо

Трансформированные клетки, включаю щие в себя рекомбинант ные плазмиды, содержащие к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФНО, отбирают из набора к-ДНК гибридизационным анали- зом с использованием фрагментов ДНК, полученных из клонированной к-ДНК, ко дирующей кроличий ФНО, в качестве пробы.

к-ДНК, кодирующую кроличий ФНО, выделяют из рекомбинантной плазмиды рК TNF 802, Последовательность оснований представлена в табл. 3. Расщеп- ляют- рестрикционной эндонуклеазой Na I или Нае И, Отщепленные фрагменты ДНК выделяют осаждением из эта- нола. Их подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле для вьщеления целевых фрагментов ДНК.

Фрагмент ДНК (299 ПоО.), соответ ствующий основаниям от 285 до 583, ка показано в табл. 3, получают расщеп- лением рестрикционной эндонуклеазой Ava I (обозначают как Ava 1-фрагмент) даугой фрагмент ДНК (88 п.о,), соответствующий основаниям от 33 до 120, как показано в табл. 3, получают расщеплением с помощью рестрикционной эндонуклеазы Нае II (обозначают как Нае 11-фрагмент). Ava 1-фрагмент и Нае 11-фрагмент метят радиоактивной меткой Р. Эти меченшш фрагменты ДНК используют в качестве пробы для проверки набора к-ДНК и отбора трансформированных клеток, имеющих плаз- М1аду, содержащую к-ДНК, кодиругадую

полипептид человеческого ФНО, коло- нар ным гибридизационным анализом в соответствии с методикой Hanahan и Meselson.

лу

с использованием Р-меченного Ava 1-фрагмента в качестве пробы при первом отборе из приблизительно 20000 клонов выбирают 43 клона. Кроме того, эти 43 выбранных клона подвергают второму отбору с использова

32.

нием Р-меченного Нае 11-фрагмента в качестве пробы.

С помощью этих анализов отбирают 6 клонов, имеющих ; екомбинантные плазмиды, сильно гибридизующиеся к-ДНК, с помощью обоих фрагментов к-ДНК кроличьего ФНО.

Экспрессия.

Выделяют ДНК рекомбинантной плазмиды из 6 трансформированных организмов, а именно: плазмиды № pHTNF 1, pHTNF 4, pHTNF 5, pHTNF 13, pHTNF 22 и pHTNF 26 соответственно, Каждую из рекомбинантных плазмид вводят в Е.со- 11 НВ101 для получения трансформированных организмов, содержащих реком- бинантные плазмиды.

Трансформированные клетки культивируют в 50 мл LB-бульоне (состав: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлористого натрия на 1 л; рН 7,5) до тех пор, пока мутност культуры, измеряемая при 600 им, не достигнет приблизительно 0,8.. После этого собирают приблизительно 3-5 х10 клеток. Клетки лизируют с неболь модификациями методики Клетки суспендируют в 1 мл 50 мМ буфера трис-НС1 (рН 8,0), содержащего 0,1% лизоцима и 30 мМ NaCl. После выстаивания в течение 30 мин в ледяной воде клетки подвергают лизису шестикратным замораживанием-размораживанием. Клеточные остатки у даляют центрифугированием и получают просветленный лизат. Лизат, полученньй из каждого трансформированного организма, подвергают анализу на цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-929.

Было установлено, что лизат, полученный из трансформированного организма, содержащего ттазкипу pHTNF 13, имеет цитотоксическуш активность 186,1 единицы (Ъ-929)/мл.

Определение последовательности оснований в клонированной к-ДНК.

Рекомбинантную плазмиду pHTNF 13 выделяют так, как описано выше. .

мидную ДНК расщепляют с помоа;ыо ре- стрикционной эидонуклеазы Pst I и выделяют клонированную к-ДНК, введенную в вектор. После этого фрагмент клонированной к-ДНК расщепляют различными рестрикционными эндонуклеазами, и последовательности оснований, результирующих 16 фрагментов, определяют, по, методике Maxam-Gilbert с использованием клеток L-929 в качестве клеток- мишеней. Кроличий плазменньй ФНО предварительно разбавляют фосфатным солевым буфером и разбавленный раствор используют в качестве контрольного образца ФНО. Как показывают представленные результаты (см. табл. 10), цито- токсическая активность полипептида - человеческого ФНО не нейтрализуется- антителом.

Таблица 10

бразец

Антитело против кроличьего, плазменного ФНО

Цитоток- сичёская активностьединиц (L-929)/мл

Лизат из тран- Не добавля- 186,1

сформированное лось

го организма,

содержащего

плазмиду

pHTNF 13 Добавлялось 191,0

КрОЛИЧ Ш

плазменный

РНОНе добавлялось 572,3

Добавлялось СО,1

Цитотоксическая активность показа-- на как активность в растворе первоначального образца, используемом для испытания. П р и м ё р 5.

Получение полипептида человеческо- го ФНО в Escherichia coli,-

Экспрессия под контролем промотора tac.

Клонированную к-ДНК выделяют из рекомбинантной плазмиды pHTNF 13. 50 к-ДНК затем расщепляют с помощью ре- стрикционной эндонуклеазы Есо R I для отщепления части некодирующего участка ниже участка, кодирующего ФНО. Ре- зультирующи фрагмент ДНК (приблизи- 55 тельно 1,1. т,п.о.) вводят в больший фрагмент ДНК, полученный из плазмиды pBR 322, расщеплением рестрикционными

0 5

эндoнyклeaзa rи Pst I и Есо R 1и коц- струируют рекомбинантную плазмиду, вютючающую в себя к-ДНК ФНО и ген устойчивости к тетратдиклин у, называе- мьй рНТ 113.

к-ДНК, выделенную из рНТ 113, расщепляют рестрикционными эндонуклеазами Ava I и Hind III и результирующий фрагмент ДНК (578 п.о.), включающий в себя большую часть участка, кд- дирующего полный полипептид человеческого ФНО (называемый ЧФНО-фрагмент), выделяют с помощью электрофореза на полиакриламидном геле.

Фрагмент ДНК, включающий в себя участок промотора tac, выделяют сле- дующим образом. Плазмидпую ДНК (300 мкг/pDR 540) растворяют в 2 мл 10 MiM буфера трис-НС1 (рН 7,5), содержащего 50 мМ NaCl, 6 мМ MgCl2 и б мМ 2-меркаптоэтанол, и расщепляют рестрикционными эндонуклеазами Есо R I .и Вага HI инкубированием при 37°С в течение 60 мин. Посл е добаБленкя хло- .ристого натрия до результирующей концентрации 0,3 М отщепленные фрагмен- ты ДНК вьщеляют из этанола, Фрагмент ДНК, включакоций в себя участок промотор .я tac, выделяют электрофорезом на полиакрилашздном геле с выходом 8,3 мкг.

Фрагмент промотора tac связывают с химически синтезированным олигоде- зоксирибонуклеотидным адаптором, представленным следующе формулой:

5 -GATCCATGTCATCTTCTCGAACC 3 -GTACAGTAGAAGAGCTT;;GGGCT

Этот адаптор включает в себя инициирующий кодон ATG и последовательность оснований, соответствующую . 5 -концевой части последовательности оснований, кодирующей полный полипептид человеческого ФНО, и имеет Ват HI- и Ava I -когезивные концы. Результирующий фрагмент ДНК назьшают tac - промотор-адапторным фрагментом.

Отдельно больший фрагмент ДНК (приблизительно 4,3 т.п.о.), включающий в себя ген устойчивости к ампицил- лину (называемый фрагментом pBR 322-Амп вырезают из плазмиды pBR 322 расщеплением рестрикционны ш эндонуклеазами Hind III и Есо R I и вьщеляют гель-электрофорезом с использованием агарозы (0,7%) с низкой тe mepaтypoй размягчения.

1 мкг ЧФНО-фрагме)та и 6 мкг фрагмента pBR 322-/-1мп растворяют в 66 мМ

буфере трис-HCl (рН 7,6), содержащем 6,6 мМ хпористьй магний, и инкубируют при 55 с в течение 10 мин. После этого прибавляют АТФ и дитиотреитол, соответственно до концентраций 1 и 10 мМ, прибавляют 168 единиц Т ДНК-ли- га зы и смесь инкубируют при 22°С в течение 120 мин. Результирующий фрагмент ДНК вьщеляют экстракцией фено; лом и получают приблизительно 4 мкг. Фрагмент ДНК (0,8 мкг) связывают с tac-промотор-адапторным фрагментом (0,3 мкг) в тех же условиях, как описано выше, за исключением того, что . используют 63 единицы Т ДИК-лигазы.

, Реакционную смесь разбавляют в 6 раз

: дистиллированной водой и смеет-твают с

равным объемом суспензии клеток

lE.coli IM103/P-1i, обработанной каль- 20 просветленньй лизат.

Трансформированный 1М103/рНТТ26 культиви ночи в бульоне LB при

с (0,5 мп) высевают в 5 она LB и дополнительн при 37°С в течение 1 прибавляют изопропилтозид до результирующ

10 1 мМ и культивировани в течение 4 ч. Клетки пензируют в 1 мл 50 м (рН 8,0), содержащего и 30 мМ NaCl, и oc-j ав

15 в течение 30 мин. шесть раз повторяют з смеси сухой лед - эта живание при , кле удаляют центрифугиров

: цием--оледующим образом. Смесь после- I довательно инкубируют в ледяной воде ; в течение 20 мин, при с течение ; 1 мин и при комнатной температуре в течение 10 мин и прибавляют бульон LB. Смесь встряхиаают при 37°С в течение 60 ьмн. Аликвоту результирующей клеточной .суспензии наносят на LB-araЛизат имеет цитотоксическую активность, равную 99000 единиц (Ь-929)/мл.- Эта цитотоксическая активность не нейтрализуется антителом против кро- 25 личьего плазменного ФНО, Это подтверждает тот факт, что полипептид человеческого ФНО иммунологически не пересекается с кроличьим плазменным ФИО, Экспрессия под контролем промоторазлагают рестрикционными эндонукле- азами Ava I и Sal I для расщепления на 3 фрагмента (размером приблировые пластинки, содержащие ампициллин в концентрации 25 мкг/мл, и куль- ЗО ра trp.

тивирук Т в течение ночи при 37ос, От- Рекомбинантную плазмиду рНТ 113 бирают колонии, устойчивые к ампициллину.

Один из трансформированных организмов, способный вырабатьшать полипеп- зительно 0,8, 1,3 и 2,6 к.п.о.). Фраг- тид человеческого ФНО, бып назван мент 1,3 к.п.о. - ДНК, включающий в ММ103/рИТТ26„себя большую часть участка, кодирующего полный полипептид человеческого

Обработанные кальцием ютетки E.coli фно и часть гена устойчивости к тет- IM103 получают следующим образом, д рациклину вьщеляют (обозначают как Клетки E.coli IM103 высенают в Ava I - Sal I-фрагмент) Ava I - Sal I- cH и культивируют при 37°С в течение фрагмент связьшают со следующим, хи- ночи. 1 мл результирующей культуры мически синтезированным олигодезокси- высевают в 100 мл LB-бульона н.допол- рибонуклеотидным адаптором. Этот адап- нительно культивируют при 27°С до тех тор обозначают как адаптор 1 пор, пока мутность культуры, опреде- 5 -CGATATGTCATCTTCTCGAACC, ляемая при 650 нм, не достигнет 0,6, 3 - j:ATACAGTAGAAGACCTTGGGGCT После выстаивания в течение 30 мин в ледяной воде клетки собирают центрифу- Результируюп ий фрагмент ДНК обозначает как ЧФНО-адапторный фрагмент. 50

гированием и суспендируют в 50 мл. 50 мМ раствора хлористого кальция,, после чего вьщерживают при 0°С в течение 60 мин,Клетки собирают центрифугированием и снова суспендируют в 10 мл 50 мМ раствора хлористого кальция, содержащего 20% глицерина, и эту суспензию используют в качестве обработанной кальцием суспензии клеток E.coli IM103.

Отдельно фрагмент ДНК (35 п,о,), включающ Ш в себя часть участка промотора trp, отрезают от пд змиды pDR 720/P-L расщеплением рестрикционными эндонуклеазами Есо R I и Нра. I, и фрагмент ДНК связьшают с химически синтезированным адаптором, имеющим следующую формулу:

Трансформированный организм 1М103/рНТТ26 культивируют в течение ночи в бульоне LB при 37 С, Культуру

(0,5 мп) высевают в 5 мл свежего бульона LB и дополнительно культивируют при 37°С в течение 1 ч. После этого прибавляют изопропилбета-Б-тиогалак- тозид до результирующей концентрации

1 мМ и культивирование продолжают еще в течение 4 ч. Клетки собирают к суспензируют в 1 мл 50 мМ буфера трис-НС (рН 8,0), содержащего 0,1% лизоцима и 30 мМ NaCl, и oc-j авляют стоять при

в течение 30 мин. После этого шесть раз повторяют замораживание в смеси сухой лед - этанол и размораживание при , клеточные остатки удаляют центрифугированием и получают

Лизат имеет цитотоксическую активность, равную 99000 единиц (Ь-929)/мл.- Эта цитотоксическая активность не нейтрализуется антителом против кро- личьего плазменного ФНО, Это подтверждает тот факт, что полипептид человеческого ФНО иммунологически не пересекается с кроличьим плазменным ФИО, Экспрессия под контролем промотора trp.

разлагают рестрикционными эндонукле- азами Ava I и Sal I для расщепления на 3 фрагмента (размером прибли Рекомбинантную плазмиду рНТ 113

зительно 0,8, 1,3 и 2,6 к.п.о.). Фраг мент 1,3 к.п.о. - ДНК, включающий в себя большую часть участка, кодирующе

5 -AACTAGTAC(;CMGTT(;ACGTAAAAAGGGTMT 3 -TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAG

Связанный фpaгмe fт ДНК обозначают как фрагмент промотора trp, -

Плазмиду pBR 322 расщепляют рест- рикционными эндонуклеазамн Есо R I и Sal I и выделяют больший фрагмент ДНК (приблизительно 3,7 к.п.о.). Последовательным связыванием этих трех фраг- ментов ДНК, фрагмента ЧФНО-адаптора, фрагмента промотора trp и большего фрагмента pBR 322 конструируют экспрессивную плазмиду pHTR 91. Экспрес сивную плазмиду вводят в клетки E.coli НВ101 способом, и один из трансформированных организмов назьша- ют HBIOI/pHTR 91,TpaHcmopNMpOBaHHHM организм НВ101/рНТР 91 культивируют в течение ночи при 37°С в модифицированной среде М-9 (состав: О, 7% 1 2Н20; 0,3% 0,05% NaCl; 0,1% 2 мг/мл витамина 0,5% казамино- вой кислоты, 1 мМ О,1 мМ CaClg и 0,5% глюкозы). Культуру (0,05 мл) высевают в 5 мл той же самой среды и культивируют при 37°С в течение 1 ч. После этого прибавляют 3-бета-индол- акриловую кислоту др результирующей концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение 4 ч. Клетки собирают и обрабатьшают по описанной методике и получают просветленный лизат.

Лизат имеет цитотоксическую активность 1,01-10 единиц (L-929) на 1 -мл.

Экспрессия под контролем промото- гра phoS.

Полученный фрагмент Ava I - Sal I, связывают с химически синтезированным рлигодезоксирибонуклеотидным адапто- jpoM, имею1 щм следующую последователь- йость:

5 -САТССАТСТСАТСТТСТССААСС

З -СТлСАСТАСААСАССТТССССССТ

Связанный фраг мент ДНК расщепляют рестрикционной эндонуклеазой Ват Н I и получают фрагмент ДНК, имеющий на обоих окончаниях когезивные концы Вага Н I (обозначают как фрагмент ЧФНО-Тет Вага Н I).

Отдельно плазмиду pSN 5182, содержащую ген phoS,; расщепляют реет- рикционной эндонуклеазой НрА I и Есо R I и получают фрагмент ДНК (приблизительно 4 к.п.о.), включающий

5 5

и себя участок промотора phos и пос- ледовательность Shine-Dalgarno, rtoc- ледовательность ДНК, кодир тощую сиг- нальньш пептид и N-конце вую часть связывающего фосфат белка, а также ген устойчивости к тетрациклину.

Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент Нра I - Есо R,I, Фрагмент Нра I - Есо R I связывают с химически синтезированным олигодезоксирибонук- леотидом-связьшателем, имеющим следующую последовательность: 5 -CCCGGATCCGOG -3 -GGGCCTAGGCCC После этого связанный фрагмент ДНК расщепляют рестрикционной эндо- . луклеазой Ват Н 1. Результирующий фрагмент ДНК (приблизительно 3,6 к.По о,), имеющий когезивные концы Вага Н I на обоих окончаниях, обозначают как фрагмент промотор Phos Вага Н I, Тет,

Фрагмент ИФНО-Тет, Ват Н I связывают с фрагментом промотор Phos - Вага Н I, Тет и конструируют экспрессивную плазмиду для получения полипептида человеческого ФНО, связанного со связывающем фосфат белком, которую называют pHTS 115, Экспрессивную плазмиду вводят в E.coli HB-IOI по вышеописанной методике.

Одним из трансформированных организмов (HB101/PHTS 115) культивируют в 5 мл среды TG (состав: 120 мМ буфер трис-НС1, рН 7,4, содержапщй 0,2% глюкозы, 80 мМ NaCl, 20 мМ КС1, 20 1.Ш , 3 мМ Ma., 1 мМ MgCi,, 0,2 мМ СаС, 200 нМ FeCl, 20 мг/л лейцина, 20 мг/л пролина и 10 мг/л витамина В), в которой при-, сутствует КН 14)4 в концентрации 0,64 мМ, при 37°С в течение 20 ч, при встряхивании. Клетки собирают центрифугированием, - снова суспендируют в 2 мл среды TG, содержащей в концентрации 0,064 мМ, и культивируют при в течение 6 ч. Клетки собирают центрифугированием и промьшают 1 мл 10 мМ буфера трис-НС1 (рИ 7,2), содержащего 30 мМ NaCl. После этого их снова суспендируют в 0,2 m 33 мМ буфера ТРИС-НС1 (рН 7,2) и смешивают с равным объемом 33 мМ буфера трис- НС1 (рН 7-, 2), содержащего О, 1 мМ ЭДТУК и 40% сахарозы. После инкубирования при 37°С в течение 10 мин, клетки собирают, снова суспендируют в 0,4 мл охлая51;екиого 0,5 мМ раствора

MgCl, и оставляют стоять в ледяной воде в течение 10 мин при периодическом встряхивании. Клеточные остатк удаляют центрифугированием и получа- ют просветленный экстракт (далее обозначается как периплазмический экстракт) .

Периплазмический экстракт имеет 1щтотоксйческую активность 1,3440 единиц (L-929) на 1 мл.

Молекулярный вес полипептида, имеющего цитотоксическую активность, определенный электрофорезом на полиак- риламидном геле (12,5%) с додецилсуль фатом натрия, равенJ9000 дапьтон, это свидетельствует о том, что полипептид получается в виде соединенного белка.

Экспрессия под контролем промотора PhoS.

Рекомбинантную плазмидную ДНК (pHTNF 13) расщепляют рестрикционной :эндонуклеазой Pst I для вырезывания .1 фрагмента ДНК (приблизительно 1,2 т,п.о.), включающего в себя к-ДНК человеческого ФИО. Фрагмент ДНК далее расщепляют рестрикционной эвдонукле- азой ВЬе 1 и получают фрагмент ДНК .(приблизительно 0,9 т.п.о.; далее 060Означается как фрагмент ВЬе I - Pst I) 6 мкг фрагмента ВЬе I - Pst I растворяют в 80 мкл 20 мМ буфера (рН 8,0), содержащего i2 мМ СаС, 12 мМ MgCl., 0,2 М NaCl, 1 мМ ЭДТУК и 0,02 единицы экзопуклёазы Bal 31, и инкубируют при 30°С в течение 30 мин для отщепления приблизительно 50 - .150 пар оснований с каядого конца фрагмента ДНК. Затем концы фрагмента снова наращивают инкубированием при 37 С в течение 60 мин с 10 единицами ДНК-полимеразы I.E.coli (большой фрагмент) в присутствии кащого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, дГТФ, дАТФ, дЦТФ и дТТФ, взятых в концентрации Oj1 мМ, и 50 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. Фрагмент ДНК с нарощенными концами расщепляют рестрикционной эндонуклеазой ECO R I и результирующий фрагмент ДНК (приблизительно 750 и.о., имеющий тупой конец и Есо R I - лепкий конац выделЕют с выходом приблизительно 3 мкг (обозначают как Bal 31 - Есо R 1-фрагмент).

Bal 31 - Есо R 1-фрагмент связывают с фрагментом Нра I - Есо R I

г JQ

25 30 Q Q

(приблизительно 4 т.п.о.), полученным из pSN 5182, и конструируют экспрессивную плазмиду, содержащую участок промотора phoS, последовательность Shine-Dalgano, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид и N- концевую часть связьшающего фосфат белка, и последовательность ДНК, ко- дируюгцую полньй полипептид человеческого ФНО и часть его пoлипeптидa-пpe ;- шественника.

Экспрессивную плазмиду называют pHTS 37 и вводят ее в E.coli НВ101 с получением трансформированного организма, который называют HBIOI/pHTS 37. Трансформированный организм НВ101/ /pHTS 37 культивируют и периплазмический экстракт получают-в тех же условиях.

Полученный периплазмический экстракт имеет цитотоксическую активность, равную 4,93 «10 единиц (L-929) на 1 мл.

Экстракт подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле (12,5%) с додецилсульфатом натрия. Электрофорез проводят при 35 В в течение 12 ч с использованием трис-глицинового (рН 8,3) буфера, содержащего 0,1% доде- цилсульфата натрия. Белок окрашивают Кумасси бриллиантовым голубым. Две полосы белка, не наблюдавшиеся в экстракте E.coli НВ101, наблюдают в положениях, соответствующих 22000 и 16500 дальтон. Отдельно гель нарезают на кусочки шириной 2 мм и калздый кусочек геля встряхивают в минимальной питательной среде Eagle, содержащей 1% зародьшевой бычьей сыворотки, при в течение ночи для элюирования белка из геля. Карвдый элюат используют для определения цитотоксической активности по отношению к мьш1иным клеткам L-929. В результате устанавливают, что сильная цитотоксическая активность наблюдается в элюате, полученном из геля, вырезанного из положения, соответствующего белку, окрашиваемому Кумасси бриллиантовым голубым, и имеющему установленный молекулярный вес, равньй 16500 дальтон.

Исходя из структуры экспрессивной гшазмиды pHTS 37, делают вывод о том, что полипептид человеческого ФНО, получаемый в трансформированном организме, должен представлять собой сли- тьш белок, включающий в себя часть связывающего фосфат белка и полипеп

ТИД человеческого ФИО с частью его предгаественпика. Теоретический моле- кулярньй вес слитого белка рассчитан и равен приблизительно 23000 дальтон Молекулярньй вес полного нолипептида человеческого ФИО равен 17097 дальто Это исследование свидетельствует о том, что получаемый слитый белок может быть превращен в полный полипептид человеческого ФИО в клетке-хозяине путем ограниченного гидролиза, возможно по специфическому участку (Arg-Ser), соединяюп ему полный псли- 1пептид человеческого ФИО с частью его предшественника о

Если периплазмический экстракт инкубируют с 5 мкг/мп трипсина при 37 С в течение 1 ч и реакщонную смес подвергают электрофорезу на полиакрил амидном геле с додецилсульфатом натрия в описанных выше условиях, то наблюдают белковую полосу, соответствующую молекулярному весу около 22000 дальтон, которая представляет собой слитьй белок, исчезающий при расщепляющем действии трипсина,

П р и м е р 7, Получение модифицированного полипептида человеческого ФИО.

Экспрессивную плазмиду рНТ RD 4, содержащую ДНК,- кодирующую полипептид получающийся в результате отщепления четырех аминокислот из N-окончания полного полипептида человеческого ФИО, конструируют таким же образом, как и экспрессивную плазмиду pHTR 91, за исключением того, что вместо адап- тора 1 используют следующий синтетический адаптор: 5 -CGATATGACC З -TATACTGGGGCT

С помощью этого синтетического адаптора последовательность оснований за которой следует инициирующий ко- дон (ATG), кодирует аминокислотную последовательность, состоящую из 151 аминокислотного остатка, являющейся результатом отщепления четырех аминокислот (Ser-Ser-Ser-Arg) от N-окончания полного полипептида человеческого ФИО.

Экспрессивную плазмиду pHTRD4 вводят в E.coli НВ101, и тpaнcфop шpoвaн ный организм культивируют в течение ночи при 37°С ц модифицированной ере- де М-9. Культуру (0,05 мл) высевают в 5 МП той ке самой среды и культивируют при в течение 1 ч. После

5 ../

этого прибавляют 3-бета-1 ндолакрило- БУЮ кислоту в результир пощей концент- рации 20 мкг/мп и культивирование продолжают Б течение ночи. Клетки собирают центрифугированием и обрабатывают по той же самой методике, как описано в примере 2, и получают просветлен- ньш лизат.

Лизат цитотокспческую активность 1,1-10 единиц (L-929) на 1 мл.

П р и м е р 8. Получение полипеп- Т1-1да-предшественника человеческого ФИО в Escherichia coli,

Экспрессивную плазмиду pHTR рЗ, содержащую к-ДНК, кодирующую поли- пептид-предгаественник человеческого ФИО, конструируют следующим образом. Клонированную к-ДНК вьщеляют из ре- комбинантной плазмиды рНТ 113 двойным расщеплением рестрикционными эндо- нуклеазами Pst I и Hind III, и фрагмент к-ДНК затем дополнительно час- тично расщепляют рестрикционкой звдо- нуклеазой Agi AI с получением фрагмента ДНК (приблизительно 820 п.о.), включающего в себя последовательность оснований, кодирующую большую часть полипептида-предшественника. Результирующий фрагмент ДНК связьшают схимически синтезированным олигодезоксири- бонуютеотидным фрагментом, имеющим следующую формулу: 5 -CGATATGAGCA 3 -ТАТАС

Связанный фрагмент ДНК называют фрагментом Рге-ФНО.

Отдельно фрагмент ДНК, содержащий часть участка промотора trp, вырезают PI3 плазмиды pUR 720 расщеплением рестрикционной эрщонуклеазой Есо R I и Ира I, и фрагмент ДНК связывают со следующим химически синтезирован-. / ньв-i адаптор ом

.CTAGTACGC/:AGTTCACGTAAAAAGGGTAAT 3 -TT(;ATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAGC

Результирующий фрагмент ДНК связы- вают с фрагментом Рге-ФНО и связан- ньй фрагмент ДНК объединяют с фрагментом ДНК (приблизительно 4,3 т.п.о.), имею111;им ген устойчивости к ампициллину, выделенньй из плазмиды pBR 322 расщеплением рестрикщшнными эндо- нуклеазами Есо К 1 и Hind III.

Экспрессивную n- ia Mn/ty pHTR РЗ конструируют по пыкк .оппсаниой методике и вводят в К.coli. НВ101, и тран-- сформированный орт .-игплм культивируют

в течение ночи при в модифицированной среде М-9, Культуру (0,05мл) высевают в 5 мл той же самой среды и культивируют при 37 С в течение 1ч. После этого прибавляют 3-бета-индол- акриловую кислоту с получением результирующей концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение ночи. Клетки собирают центрифугирова- |Q нием, получают просветленный ,

Лизат имеет цитотоксическую активность, равную 1,8-10 единиц (L-929) на 1 мл о

II р им ер 9, Получение и очистка 15 гаеописанную операцию повторяют, Элюполипептида человеческого ФИО.

Получение в Escherichia cell.

Трансформированньш организм НВ101/ /рНТ 91 используют для получения полиаты, имеющие цитотоксическую активность, объединяют и концентрируют с помощью ультрафильтрации так, как опи сано выше. И, наконец, концентрат напептида человеческого ФИО. Трансформи-2о носят на колонку (0,7x25 см) с BiOGel Р-6;-(B10-RAD) и обессоливают.

Результирующий обессоленньй образец, имеюрщй цитотоксическую а;ктив- ность, является однородным с точки 25 зрения электрофоретического анализа

|рованньм организм культивируют в Tei (чение ночи при З7 с в е)ульоне LB; содержащем тетрациклин в концентрации ,12,5 «кг/мпо Культуру высевают в 10 объемов модифицированнот; среды

М-9 и культивируют при 37°С в течение 1 ч. После прибавле1шя 3-бета-индол- акриловой кислоты в результирующей концентращи 20 мкг/мл тсультивирова- ние продолжают в течение 4 ч. Клетки ЗО собирают, обрабатьгоают и получают пр О- светленный лизат. Лизат используют дпя очистки полипептида челрвеческо- . го ФИО.

. , 35

Очистка ; полипептида человеческого ФИО.

Полипептид человеческого ФИО очи- щают из лизата по следующей методике. В колонку (5x20 см), набитую DEAE-Sep-40 harose CL 6В, предварительно приведенную в состояние равновесия относи- TejibHO 20 мМ буфера трис-НС1 (рН 7,8), вводят 1030 мл лизата. Колонку промывают 3 л того же. самого буфера, а 45 затем элюируют линейньп градиентом Nad от нуля до 0,3 М в том же самом буфере со скоростью потока, равной 133 МП/ч. Элюат фракционируют по ф1 акна полиакрйламидном геле с дод сульфатом натрия, и его исполь качестве очищенного полипептид веческого ФИО для проведения а

Пример 10. Способ полу лиофилизованного полипептида ч ческого ФИО.

Раствор очищенного полипепт ловеческого ФИО используют для чения лиофилизованного полипеп человеческого ФИО.

10 мл раствора очищенного п тида человеческого ФИО, имеюще тотоксическую активность 2, ниц (LM) смешивают с 0,1 объем NaCl, содержащего 10% человече сывороточного альбумина и 20% нита. После доведения рН раств 6,8 результирующий раствор сте ют фильтрованием через мембран roflow. По 5 мл стерильного р ра помещают в стеклянные сосуд офильно высуржвают. Каждый сос держит по 10 единиц (LM) очищ

циям 10 мл. Фракции, обладающие цито- 50 °™пептида человеческого ФИО.

токсической активностью, собирают и объединяют,

Вьделение цитотоксической активности на этой стадии составляет 53%, удельная активность повышается приблизительно в 9 раз.

Соединенные активные фракции обессоливают и концентрируют до 1/10 объеПример 11. Получение к кроличьего ФИО.

Получение и-РНК ФИО из крол альвеолярных макрофагов.

Кроликам (массой приблизител 2,5 кг) внутривенно вводят мер кие клетки Propioni bacterium в дозе 100 мг на кролика, и чер дней кроликов забивают. Легкие

ма ультрафильтрацией с помощью Diaflo - с использованием мембраны УМ10.

Концентрат подвергают препаративному изоэлектрофокусирующему гель-электрофорезу. Аликвоту концентрата наносят на пластинку из полиакриламидно- го геля (0,2x10x10 см) с градиентом рН от 5,6 до 6,1, созданном с помощью Imraobiline. Электрофорез проводят при напряжении 2400 В в течение 16 ч при . Гель нарезают на куски шириной 10 мм и белок элюируют с помощью 20 мМ буфера трис-НС1 (рН 7,8), Выаты, имеющие цитотоксическую активность, объединяют и концентрируют с помощью ультрафильтрации так, как описано выше. И, наконец, концентрат нана полиакрйламидном геле с додецил- сульфатом натрия, и его используют в качестве очищенного полипептида человеческого ФИО для проведения анализа.

Пример 10. Способ получения лиофилизованного полипептида человеческого ФИО.

Раствор очищенного полипептида человеческого ФИО используют для получения лиофилизованного полипептида человеческого ФИО.

10 мл раствора очищенного полипептида человеческого ФИО, имеющего цитотоксическую активность 2, единиц (LM) смешивают с 0,1 объема 8% NaCl, содержащего 10% человеческого сывороточного альбумина и 20% D-ман- нита. После доведения рН раствора до 6,8 результирующий раствор стерилизуют фильтрованием через мембрану Mic- roflow. По 5 мл стерильного раствора помещают в стеклянные сосуды и ли- офильно высуржвают. Каждый сосуд содержит по 10 единиц (LM) очищенного

°™пептида человеческого ФИО.

Пример 11. Получение к-ДНК кроличьего ФИО.

Получение и-РНК ФИО из кроличьих альвеолярных макрофагов.

Кроликам (массой приблизительно 2,5 кг) внутривенно вводят мертвые су- кие клетки Propioni bacterium acnes в дозе 100 мг на кролика, и через 8 дней кроликов забивают. Легкие нес57

колько раз промывают фосфатным солевым буфером через трубку, введеннуто в трахею животного, и собирают альвеолярные макрофаги, Из 12 кроликов получают приблизительно З Ю альвеолярных макрофагов,

Альвеолярные макрофаги суспендируют в среде R РМ1-164О, ,содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 см) с плотностью клеток клеток на чашку. Их предварительно культивируют при 37 С в полностью влажной атмосфере, содержаще 5% двуокиси углерода. После предварительного культивирования, проведенного в течение 1 ч, эндотоксин (липополисахарид, полученный из E.coli), ТРА (форбол- -12-миристат-13-ацетат) и циклогек- симид (ингибитор синтеза белка) прибавляют, таким образом, чтобы их результирующие концентрации были равны соответственно 10 мкг/мл, 10 нг/мл и 1 , Культивирование продолжают еще в течение 4-4,5 ч (общее рремя культивирования 5-5,5 ч), культураль- ную среду удаляют отсасыванием, и макрофаги, адгезированные к чашкам, ли- :аируют и гомогенизируют в 5 М растворе гуанидил-цианата содержащем. 0,6% N-лауроилсакрозината натрия и 6 мМ цитрата натрия.Гомогенизат вьшивают в 5,7 М раствор хлорида цезия, содержащий 0,1 М ЭДТУК,. и центрифугируют в течение 20 ч при 26500 об/мин с использованием ультрацентрифуги, с получением фракции общей РНК в виде гранул. Гранулы растворяют в небольшом количестве 7 М раствора мочевины, содержащего 0,35 М NaCl, 20 мМ трис-НС1 (рН 7,4) и 20 мМ ЭДТУК, и выделяют осаждением из этанола. Из 12 кроликов получают 5,2 кг общей РНК. .

Фракцию общей РНК растворяют в 2 мл раствора ТЭ, раствор нагревают при 65 С в течение 5 мин. Добавляют раствор NaCl до результирующей концентра- 1ЩИ 0,5 М, и раствор наносят на колонку с олиго(дТ)-целлюлозой, предварительно приведенной в равновесие по отношению к ТЭ-раствору, содержащему 0,5 М NaCl. Поли(А)-и-РНК элюируют из колонки с помощью ТЭ-раствора с выходом 314 мкг. Результирующий поли(А)- -и-РНК подверга от электрофорезу на агарозном геле (концентрация геля 1%, в присутствии 6 М мочевины, рИ 4), и фракционируют на 7 фракций в соответ

1476558

ствии с молекулярными размерами, Поли (Л)-и-РНК выдапяют ия каждого фрак ционироБанного геля, расплавляя его

г при 70 С в течение 10 мин с последующей последовательной экстракцией фенолом и хлороформом и осаждением из этанола. Содержание и-РИК кроличьего ФИО в поли(А)-и-РНК, выделенной из каждой

Q фрающи, определяют и-РНК-трансляци- онным анализом с использовагашм ооци- тов Xenopus leavis,

Более высокую концентрацию и-РНК кроличьего ФНО выделяют из фракции,

15 соответствующей молекулярному размеру 1,6-2,7 к в (сокращенно называют обогащенной и-РНК кроличьего ФНО),

Фракцию, обогащенную и-РНК кроличьего ФНО, полученн то таким образом,

20 используют в последующих экспериментах.

Синтез к-ДНК.

к-ДПК синтезируют в следующих условиях. 4 мкг фракции обогащенной..и-РНК

25 кроличьего ФНО растворяют в 100 мкл 50 мМ буфера трис-НС1 (рН 8,3), содержащего 10 мМ MgCl2, 70 мМ КС1, 1 мМ дитиотреитол, 0,5 мМ концентрацию каждого из следующих дезоксирибонуклео30 тидтрифосфатов: дТТФ, дЦТФ, дАТФ и дПГФ (дСТФ метят , удельная активность 4,440 распадов в минуту нананомоль), 3 мкг олиго(дТ).;(2-л8 единиц обратной транскриптазы, полу,, ченной из вируса птичьего миелоблас- тоза, и инкубируют при 43°С в тече1ше 90 ьин. После этого реакцию останавливают прибавлением , Результирующий гибрид к-ДНК-и-РНК экст рагй40 РУют смесью фенол - хлороформ (1:1) и выделяют из водной фазы осаждением из этанола Матрицу и-РНК удаляют обработкой щелочью при 65-70 С. Синтетическую одн-ДНК вьзделяют осажде45-нием из этанола.

Осадок одн-ДНК раствор яют в 40 мкл 0,1 М буфера HepeS (рН 6,9), содержащего каждый из четырех дезоксири- бонуклеотидтрифосфатов, дАТФ, дТТФ,50 дГТФ и дЦТФ, в концентрации 0,5 , 70 мМ КС1, 5 мМ MgCl, 1,5 Ш 2-мер- каптоэтанол и 8 единиц E,coli ДИК-пс- лимеразы 1 (большой фрагмент)и инкубируют при 15 С в течение 20 ч для

ГС синтеза днп-ДНК. Реакцию останавливают прибавлением додецилсульфата нат- рия. днп-ДНК экстрагируют смесью фе- НОЛ - хлороформ и вьщеляют осаждегшем из этанола.

Результирунлцую днк-ДИК растворяют в ЮО мкл 50 мМ раствора ацетата натрия (рН 4,5), содержащего 1 мМ ZnSO, 200 мМ NaCl, 0,5% глицерин и 0,5 единшц- нуклеазы S1, и инкубируют при в течение 20 мин для расщепления структуры. Реакцию останавливают прибавлением ЭДТУК, Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол - хлороформ, а затем диэтиловым эфиром, днп-ДНК выделяют осаждением из этанола.

Получение олиго(дЦ)-концевой к-ДНК, Полученную выше днк-ДНК растворяют в 100 мкп буфера 130 мМ какодилат натрия-30 мМ трис-HSl (рН 6,8), содержащего 1 мМ CoCl, 0,1 мМ дитиотреи- тол, 0,2 мкг поли (А), 0,1 мМ Н-дЦТФ (удельная активность 5400 распадов в минуту на пикамб71ь) и 10 единиц кон- цевой дезоаксинуклеотидилтрансферазы, И инкубируют при 3 течение 20 мин для присоединения концов оли- го(дЦ) к 3-концам днк-ДНК. Реаки 1ю останавливают прибавлением ЭДТУК. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол- хлороформ и затем диэтиловым эфиром, и 6лиго(дЦ)-концевую днп-ДНК выделяют осаждением из этанола. Олиго(дЦ)-концевую днп-ДНК растворяют в 10 1 буфере трис-НС1 (рН 7.,4), содержащем 1 мМ ЭДТУК и 100 мМ NaCl, таким образом, чтобы концентрация олиго(дЦ)-концевой днп-ДНК была равна 0,2 мкг/мп.

Получение олиго(дГ)-концевой ДНК ттазшщы pBR 322 (10 мкг).

Растворяют в 100 мкл 20 мМ буфера трис-НС1 (рН 7,4), содержащего 10 мМ MgCl, 50 мМ (КНц.) и 10 мкг бычьего сывороточного aльбy шнa, и гфибавляют 15 единиц рестрикционной эндонуклеазы Pst I. Смесь инкубируют рри 37 С в течение 1 ч. После прекра- , щения реакции реакционную смесь экст- рагируют смесью фенол - хлороформ, и результирующую ДНК выделяют из водной фазы осаждением из этанола. Полученную ДНК растворяют в 200 мкл того же самого реакционного буфера, которьш использовался вьше, для присоединения к концам днп-ДНК (за исключением того, что он содержит 80 единиц концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы и Н-Д1ТФ вместо Н-дЦТФ) и инкубируют при в течение 20 мин для присоединения к концу приблизительно 10-15 остатков дГ, Реакционную смесь

экстрагируют смесью фенол - хлороформ и олиго(дГ)-концевую ДНК плазмиды pBR 322 выделяют из водной фазы осаждением этанолом. Результирующую концевую плазмидную ДНК растворяют в том же буфере, которьш использовался дпя растворения олиго(дЦ)-концевой днк- ДНК, таким образом, чтобы концентрация концевой плазмидной ДНК была равна 2 мкг/мл.

Конструирование рекомбинантной п-лазмиды.

50 мкл раствора олиго(дЦ)-концевой 5 к-ДНК смешивают с Ю мкл раствора оли- го(дГ)-концевой ДНК pBR 322, и смесь последовательно инкубируют при 65 с в течение 10 мин, при в течение 120 мрп1, при 45°С в течение 60 мин, при 35°С в течение 60 мин и при комнатной температуре в течение 60 мин для достижения связьгоания и конструирования рекомбинантнсй плазмиды.

Отбор трансформированных организмов.

Штамм E.coli X 1776 трансформируют с помощью полученной выше рекомбинантной плазмиды.

0 E.coli Х 1776 культивируют при в 20 мл бульона L, содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты и 40 мкг/мп тимидина, до тех пор, пока мутнСсть, измеряемая при 600 mji, не достигнет 0,5. Клетки собирают центрифугированием при и промывают 10 ivM буфером трис-НС1 (рН 7,3), содержащим 50 мМ СаС. Клетки снова суспендируют в 2 мп того же самого буфера и оставляют стоять при в течение 5 мин. К 0,2 МП суспензии прибавляют О, 1- мл полученного выще раствора рекомбинантной плазмиды. Смесь оставляют стоять при в течение

5 15 мин и затем вьщерживают в течение 2 мин при . После этого прибавляют 0,5 мл использованного выше бульона L с добавками и культивирование при встряхивании проводят в течение

Q 1 ч. Отбирают аликвоту культуры и наносят ее на пластинку агара с содержащим добавки бульоном L, содержащую 15 мкг/мл тетрахщклина, и культивируют при в течение приблизительно

г 12ч, Отбирают трансфор1 нрованные ор5

ганизмы, устойчивые к тетрациклину, которые используют в качестве набора к-ДНК,

Гибридизационньй анализ.

Анализ с помощью гнбрндиза хии колонии пров.одят с использованием Р-ме- ченной пробы к-ДНК для выбора в набор к-ДИК тех трансформированных организмов, которые имеют плазмиду, содержащую к-ДНК, кодир тощую кроличий ФИО. Индуктивные плюс и минус пробы Р-меченной опк-ДНК синтезируют по методике, описанной ранее, с исг пользованием н-РНК, полученной из индуктивных плюс и минус альвеолярных макрофагов, за ис1слючением того, что используют Р-дЦТФ с высокой удельной радиоактивностью, В этом испытании отбирают колонии трансформированных организмов, содержа:щих рекомби- нантные плазмиды, сильно гибридизуе- мые индуктивной плюс-пробой, но не гибридизуемые индуктивной минус-пробой. Из 20000 колоний выбирают 50 колоний .

20 из выбранных 50 колоний подвергают затем и-РНК-гибридизационно-рет- рансляционному анализу. Плазмидную ДНК экстрагируют из каждого трансформированного организма и фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах после термической денатурации. К фильтру прибавляют фракцию поли(А)-и-РНК, содер- ЗО жащую и-РНК кроличьего ФИО, и проводят инкубирование при 50°С в течение 3 ч для достижения гибридизации. Гиб- ридизованную и-РНК выделяют и вводят в ооциты для определешш того, представляет ли собой вьщелепная и-РНК и-РНК кроличьего ФИО, В результате этого испытания обнарулшвают три колонии, имеющие плазмиды, содержащие

161476562

ЗОЙ Pst I и их размеры определяют эле ктрофорезом на полиакриламид|юм геле . Отбирают 17 колоний трансформированных организмов, содержащих вставки к-ДНК размером не менее 1 к.п.о. Из трансфорш1роваиного организма, содержащего к-ДНК наибольшего размера (.трансформированньй организм 5Q i X 1 776/pR TNF 802; плазмида pRTNF 802) выделяют клонированную к-ДНК и - ее последовательность оснований определяют описываемым ниже способом.

Определение последовательности ос- (5 пований клонированной к-ДНК,

Трансформированньш организм A1776/PR TNF 802 культивируют в буль- one L, содержащем диаминопимелиновую

1ШСЛОТУ и тимидин. Клетки обрабатыва- 20 ют и получают плазмидную ДНК. ную ДНК расщепляют рестрикционной эн- донуклеазой Pst I, очищают и получают клонированную к-ДНК. Фрагмент клонированной к-ДНК расщепляют затем раз- 25 личными рестрикционными эвдонуклеаза-

ми, определяют последовательности оснований фрагментов, отщепленных подхо- дягарми рестрикционными эндонуклеавами.

Определенная последовательность оснований представлена,в табл. 9. Установлено, что последовательность оснований с 277 по 738 основание является участком, кодирующим полньй кроличий ФИО, в соответствии с Н-концевыьш и С-концевыми аминокислотными последовательностями ФНО, очищенного из кроли- 4efi плазмы. Предполагается, что основания с 34 по 276 являются последовак ДНК, сильно гибридизуемую с помощью дп тельностью оснований, кодирующих полии-РНК кроличьего ФНО. Фрагменты к-ДНК получают из плазмиды, содержащей К-ДНК наибольшего размера (около 750 п.о.), расщеплением с помощью рестрикционной эндонуклеазы Dde I, и используют в качестве пробы для дальнейшего отбора. Эти фрагменты ДНК метят Р.С использованием этих проб набор к-ДНК отбирают анализом на гиб45

пептид, необходимый для образования предшественника кроличьего ФНО.

Пример Т2. Вьщеление и очистка кроличьего плазменного ФНО.

Кроликам (массой тела 2,5-3,0 кг) внутривенной иньекцией вводят по 50 мг умерщвленных сухих клеток Рго- pionibacterium acnes. Спустя 8 дней

- .-п- X ---.. iiu. д „v кролику внутривенной инъекцией вводят

ридизацию колоний колонии трансформи-50 ° эндотоксина (липополисахарованных организмов, имеюнщх плазми-Р ВДа, полученного из E.coli). Через

ды, содержащие к-ДНК, сршьно гибриди- 2 ч из каждого кролика отбирают кровь

зуемую меченными пробами. В этом ис- сердечной пункцией. Кровь смешипытании положитачьный результат даетвают со 100 единицами гепарината кат- 98 колоний из приблизительно 60000 ко-55 Р центрифугируют при

лоний. Вьщеляютпрекомбинантнуга плаз-5000 об./мин в течение 30 мш при охмидную ДНК и вставки к-ДНК вырезаютлаждении, удаляя кпетхш крови и нераиз этих рекомбинантных плазмид рас-створимые соединения. От 400 кроликов

щеплением рестрикционной эндонуклеа-получают 24 л плазмы.

ЗО

61476562

ЗОЙ Pst I и их размеры определяют электрофорезом на полиакриламид|юм геле . Отбирают 17 колоний трансформированных организмов, содержащих вставки к-ДНК размером не менее 1 к.п.о. Из трансфорш1роваиного организма, содержащего к-ДНК наибольшего размера (.трансформированньй организм 5Q i X 1 776/pR TNF 802; плазмида pRTNF 802) , выделяют клонированную к-ДНК и - ее последовательность оснований определяют описываемым ниже способом.

Определение последовательности ос- (5 пований клонированной к-ДНК,

Трансформированньш организм A1776/PR TNF 802 культивируют в буль- one L, содержащем диаминопимелиновую

пептид, необходимый для образования предшественника кроличьего ФНО.

Пример Т2. Вьщеление и очистка кроличьего плазменного ФНО.

631

к 24 л плазмы прибавляют ЭДТУК (;24 г) и 240 г цеолита, и смесь пере еиивают в течение 1 ч, после чего последовательно фильтруют через;три фильтра с размерами пор 3, 1 и 0,2 мкм.

; К 24 л фильтрата прибавляют 12 л d,04 М буфера трис-НС1 (рН 7,8) и cJMecb наносят на колонку (27x45 см) d DEAE-Sepharose CL-бВ, уравновешен- против 0,04 М буфера трис-НС1 (|рН 7,8), содержащего 0,1 М ЫаС1,Пос .Л|е этого колонку промывают 75 л буфе р трис-НС (рН 7,8), содержащего Oi, 1 М NaCl и затем 50 л 0,04 М и бу- фЬра трис-НС (рН 7,8), содержащего 0|, 15 М NaCl, после чего элюируют Oj,04 М буфером трис-НС (рН 7,2), со- д ржардим 0,18 М NaC, Элюат фракционируют на фракции по 8 л, и собирают фракции, обладающие цитотоксической а)ктивностью. Активные фракции объеди- HJ5iOT и разбавляют равным объемом буфера трис-НС (рН 7,8). Раз- б вленньш раствор наносят на колонку (|lGx13 см) с DEAE-Sepharose-CL-6B.Ko- л|5нку промьшают 1 л 0,04 М буфера т|)ис-НС (рН 7,8), содержащего 0,1 М ЩС, и затем элюируют 5 л 0,04 М бу- трис-НС (рН 7,2), содержащего М NaC. Элюат фракционир пот на фракции по 250 мп и фракции, облада- Ю1(ще и 1тотоксической активностью, со- CijipaioT и объединяют,

i Активную фракцию нагревают при 6lj) С в тече1ше 30 мин и быстро охлаж- дфот до 4 С. Холодный раствор концентрируют ультрафильтрацией,

Результирующий концентрат наносят Ы колонку (5x80 см) с Sephacry S-200, У1)авновешенную против 0,005 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,1 М NaC, и элюируют тем же са- KbjM буфером. Элюат фракционируют на фракции по 40 мл, и активные фракции собирают, объединяют и концентрируют У4ьтрафильтра1щей,

Концентрат активной фракции, полученный гель-Фильтрацией, наносят на колонку с Zn -халатной сефарозой, ка|к это описано ниже. Колонку (1,6х х2|0 см) наполняют хелатной сефарозой (сИола с фиксированной иминодиуксус- нс1й кислотой), промывают 120 мл раст- acjja хлорида цинка (1 мг/мл) и уравновешивают по отношению к 0,05 М фосфатному бусреру (рН 7,4), содержащему 0,1 М NaC, После этого в колонку вво

476564

дят концентрат, полученный на предыдущей стадии, и проводят элюиро-вание тем же самым буфером. Собирают фрак- ции, не адсорбирующиеся на колонке. Цитотоксическая активность почти полностью выделяется в этих фракциях.

Активные фракции, полученные на предыдулдей стадии,концентрируют и на-. 10 носят на колонку (1,5хУО см) с Togo- pear HW-55, полностью уравновешеннуга по отношению к 0,005 М и фосфатному Ьуферу (рН 7,4), содержащему 0,15 М NaC. Колонку элюируют тем же самым 15 буфером и собирают активные фракции. Этот образец представляет собой очищенный кроличий плазменньй ФНО.

Пример 13.

Опредедение N-концевой и С-конце- 20 вой аминокислотных последовательностей кроличьего плазменного ФНО.

Очищенный кроличий ФНО используют дая определения N-концевой и С-конце- вой аминокислотных последовательнос- 25 тей.

N-Концевую аминокислотную последовательность определяют разложением по способу Эдмана Результирующие фе- нилтиогидантоинаминокислоты идентифи- 30 цируют жидкостной хроматографией высокого давле шя с использованием колонки Lorbax ODS.

С-Концевую аминокислотную поЬледо- ваТельность определяют ферментативным способом с использованием карбоксипеп- тидаз. Очищенньш кроличий плазменный ФНО расщепляют карбоксипептидазами А и Y при молярном соотношении фермента к субстрату, равном соответственно 0 1:25 и 1:1000, Свободные аминокислоты, выделяющиеся из С-окончания кроличьего плазменного ФНО в результате двойного отщепления, индентифицируют с помощью аминокислотного микро анали- 5 затора через соответствующие интервалы 2-180 мин после отщепления.

Было последовательно установлено, что N-концевые и С-кокцевые аминокис- лотные последовательности кроличьего 0 плазменного ФНО являются следующими

N-окончание: 8ег-А а-8ег-Аг§-А ат... С-окончание:... - Val-Tyr-Phee-C y- -I e- e-A a-Ieu

П р и М е р 14. Получение антитела против кроличьего плазменного ФНО.

Раствор ФНО, содержащий 1,9.10 единиц (L-929) очищенного кроличьего плазменного ФНО, эмульгируют с равным

объемом полного стимулятора С-рейнда, и эмульсию вводят подкожкой И117.акцией в спину морских свинок в нескольких местах, КИБОТНЫХ иммуш зуют такш-i же способом через 1,3 и 6 недель. Кроме того, через 8 недель такое же количество очищенного кроличьего плазменного ФИО вводят внутрибрюпашной инъектщей вместе с гелем гидроокиси алюьшния. Цельную кровь отбирают сердечной пункцией через 9 недель после первой иммунизации, центрифугируют .и.- получают антисыворотку, содержащую ан- тителз: против кроличьего плазменного ФНО.

Антисыворотку пропускают через колонку с Sepharose 4В, снабженную сывороточными белковыми компонентами нормальных кроликов. Проводя операцию раза, получают очищенные антите- Аа, специфические по отношению к кро- личьему плазменному ФНО. Иммуноэле10

лючающийся в том, что осу:чествляю1 культивирование чаповеческих макрофа РОВ вместе с липополисахаридом, полу ченным из Kscherichia coli и форбол- -12-ыиристат-13-ацетатом в присутствии циклогексимида, вьщеление из мак potparoB-фракции, содержаще мРНК фак тора некроза опухоли человека с использованием колонки с олиго(дТ)-цел люлозой, синтез на фракции мРНК одпс нитевой кДНК с использованием обратной транскриптазы, полученной из вир са миелобластоза птиц, в присутствии дГТФ, , дТТФ, дЦТФ, превращение в дйунитевую : кДНК с использованием ДНК-полимеразы I и рибонуклеазы Н, п лученных из E .coli, ,в присутствии дГТФ, дАТФ, дТДТФ, дТТФ, получение 20 двунитевой кДНК с олиго(дЦ)-хвостом при помощи концево дезоксинулеотид трансферазы в присутствии дЦТФ, обр tjoTKy плазмиды pBR 322 эндонуклеазой рестрикции Pst I и добавление оли 15

ктрофорез и методики двойной диффузии 25 то(дГ)-хвостов к расщепленной Pst I

через гель подтверждают, что это антитело образует одну полосу осадка с очищенным кроличьим плазменным ФНО,

Этот раствор антитела, разбавленный приблизительно в 60000 раз, обладает ЗО способностью нейтрализовать 50% от 500 единиц (L-929) . цито токсической активности кроличьего плазменного ФНО, а разбавленный в 1000 раз может полностью нейтрализовать 50 единиц (LM) , цитотоксической активности кроличьего плазменного ФИО,

ДНК плазмнды pBR 322 с использовани концевой дезоксинуклеотидилтрансфер зы в присутствии дГТФ, объединение двунитевой кДНК с олиго(дЦ)-хвостам с расщепленной Pst I ДНК pBR 322 с олигоСдГ)-хвостами, трансформацию п лученными рекомбинантными плазмидам штамма бактерий Escherichia сй11Х1 и отделение клонов, включающих реко бинантную плазм1-щу pHTN F-13, гибри дизацией с применением в качестве з да фрагментов Ava I или Нае II ре комбинантной плазмиды pRTN F802, ко дирующей фактор некроза опухоли кро лика, причем плазмида pPTN F-13, ко дирующая фактор некроза опухоли, вк чает следующую нуклеотидную и-амино кислотную последовательность;

Формула изобретения

Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pHTN 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека, зак-,

1102030

ATGAdCACTGAAACCATGATCCGGGACGTG HetScrThcGluSqrHehllcArgAspyal

40 I

50 I

60 I

GAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAG GlbLcuAlaGluGluAIaLcuProLysLys

ACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGC ThrGlyGlyProGlnGlySerArgArgCys

лючающийся в том, что осу:чествляю1 культивирование чаповеческих макрофаг РОВ вместе с липополисахаридом, полученным из Kscherichia coli и форбол- -12-ыиристат-13-ацетатом в присутствии циклогексимида, вьщеление из мак- potparoB-фракции, содержаще мРНК фактора некроза опухоли человека с использованием колонки с олиго(дТ)-целлюлозой, синтез на фракции мРНК одпс- нитевой кДНК с использованием обратной транскриптазы, полученной из вируса миелобластоза птиц, в присутствии дГТФ, , дТТФ, дЦТФ, превращение в дйунитевую : кДНК с использованием ДНК-полимеразы I и рибонуклеазы Н, полученных из E .coli, ,в присутствии дГТФ, дАТФ, дТДТФ, дТТФ, получение 20 двунитевой кДНК с олиго(дЦ)-хвостом при помощи концево дезоксинулеотид ш- трансферазы в присутствии дЦТФ, обра- tjoTKy плазмиды pBR 322 эндонуклеазой рестрикции Pst I и добавление оли5

о(дГ)-хвостов к расщепленной Pst I

ДНК плазмнды pBR 322 с использованием концевой дезоксинуклеотидилтрансфера- зы в присутствии дГТФ, объединение двунитевой кДНК с олиго(дЦ)-хвостами с расщепленной Pst I ДНК pBR 322 с олигоСдГ)-хвостами, трансформацию полученными рекомбинантными плазмидами штамма бактерий Escherichia сй11Х1776 и отделение клонов, включающих реком- бинантную плазм1-щу pHTN F-13, гибридизацией с применением в качестве зонда фрагментов Ava I или Нае II рекомбинантной плазмиды pRTN F802, кодирующей фактор некроза опухоли кролика, причем плазмида pPTN F-13, кодирующая фактор некроза опухоли, включает следующую нуклеотидную и-аминокислотную последовательность;

50 I

60 I

161476568

100 110 120

TTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATC LcuPheLeuSerLeoPheSerPheLeulle

130 140 ISO

GTGGCAGGCGCCДОСACG СTCTTCTGCCTG

ValAlaGlyAlaThrThrLcuPheCysLeu

160 170 180

« I) I

CTGCACTrrnGACTGATCGGCCCCCAGAGG LounicPhcGlyVnlllcGlyProGlnArg

190 . 200 210

. GAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATC GluGluPhcProArgAspLouSerLcuIle

220 230 240

AGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGAtrCATCT SerProLcuAlaGlnTilaVdlArgSerScr

250 260 . 270

TCTCGAJVCCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCC ScrAirgThrProScrAspLysProValAla

280 290 300

CATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGG HisValValAlaAsnProGlnAlaGluGly

310 320 330

CAGCTCCAGTGGCTGAj-VCCGCCGGGCCAAT GlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsn

34(Г 350,360

GCCCTCCTGGCCAA7GGCGTGGAGCTGAGA lilaLeuLeuAlaAsi lyValGluLeuAtg

370 300 390

GATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGXCGGC AspAsnGlnLeuValValProSerGluGly

400 410 420

CTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC LeuT yLeulleTyBSerGlnValLcuPhe

430 440 450

AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTG LysGlyGlnGlyCysProSerThrHisVal

4GO 470 4ПО

CTCCTCACCCACACCATCAGCGGCATCGCC LeuLeuThrHisThiTlleSerArglleAla

161476570

490 500 510 I . I

GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTC ValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLou

520 530 540 t

TCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAG SerAlalleLyGSerProCysGlnArgGlu

550 560 570 I

ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGG

ThrProGluGlyAlaGluAl«itysProTrp

580 590 600 - « I TATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTC TyrGluProIlcTyrLcuGlyGlyValPhc

610 G20 630

CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCT GlnLcuGluLysGlyAspArgLcuSerAl.a

. 640 650 660

I GAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTT GlulleAsnArgProAspTyrLeuAspPhe

670 680 690 I I . I

CCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGG.GATC AlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlyllc

ATTGCCCTG IIcAlaLcu

40 50 60

« « . GAGCTGGCCGAGGACGCGCTCCCC/vAGAAG GluLeuAlaGluGluAlaLeuProLysLys

70 80 90

ACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGC ThrGlyGlyProGlnGlyScrArgArgCys

. 100 110 120

IrTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATC LeuPhcLcuScrLcnPheSerPheLeuIle

130 140 150

GTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTG ValAlaGlyAlaThrThtLeuPheCysLeu

16.0 170 180

CTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGG LcuHisPhcGlyVallleGlyProGlnArg

1614765

190 . 200 210

GAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATC GluGluPhcPrbArgAspLcuScirLcuIle

220 230 240

AGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCT ScrProLcuAlaGlnAlaValArgScrSer

250 260 270

TCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCC ScrArgThrrroScrA jpI.ynrroVnlAla

200290300

. CATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGG HisValValAlaAsnProGlnAlaGluGly

310 320 330

CAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAAT GlnLcuGlnTrpLcuAsnArgArgAlaAcn

340 350 -360

GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGA AlaLcuLeuAlaAsnGlyValGluLcuArg

1 370 300 390

GATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGC AspAsnGlnLcuValValProScrG luGly

400 410 420

CTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC LeuTryLcuIleTyoSerGlnValLouPhe

430 440 450

AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTG LysGlyGlnGlyCysProSerThrHisVal

460 470 480

CTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCC LeuLcuThrHisThrlleSerArglleAla

490 500 510

GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTC ValSerTyrGlnThrLysValAsnLcuL u

520 530 540

TCTGCCATCAAGAGCCCGTGCCAGAGGGAG SecAlallcLysSerProCysGlnArgGlu

550 5GO 570 I

ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAUCCCTGG ThrProGluGlyAlaGluAlnLycProTrp

5ПО 590 COO

I TATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTC TyrGluProIleTyrLeuGlyGlyValPhe

31b1a7h5

,610 620 630

CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCT GlnLcuGluLysGlyAspArgLeuSorAla

.640 650 660

GAGATCAATCGGCCCG ACTATCTCGACTTT GluIlcAsnArgProAspTyrLcuAspPhe

670 . 6QO 690

GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATC AlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlylle

ATTGCCCTG IleMaLeu

SU 1 614 765 A3

Авторы

Масааки Ямада

Ясуджи Фурутани

Мицие Нотаке

Юнити Ямагиси

Даты

1990-12-15—Публикация

1985-03-05—Подача

название	год	авторы	номер документа
Способ получения полипептида, обладающего активностью фактора некроза опухоли человека	1987	Мосааки Ямада Ясуджи Фурутани Мицие Нотаке Юнити Ямагиси	SU1739855A3
Способ стабилизации рекомбинантного фактора некроза опухоли	1985	Хадзиму Сакамото Такао Киета Хиратака Итох Хироси Хаяси	SU1607690A3
Способ очистки рекомбинантного фактора некроза опухоли	1985	Юнити Кадзихара Такао Киета Хироси Хаяси	SU1630602A3
Способ получения полипептида со свойствами фактора некроза опухоли	1987	Юнити Ямагиси Хитоси Кавасима Рюдзи Фурута Хиротада Котани Катухиса Наката	SU1762761A3
Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей зимоген С человека	1988	Нильс Ульрик Бэнг Хармут Джозеф Эрлих Брайан Вилльям Гриннелл Сау-Чи Бетти Ян	SU1739854A3
Способ получения водорастворимой части человеческого рецептора малого сродства F @	1987	Тадамитсу Кишимото Масаки Суемура Хитоши Кикутани Эдвард Барсумиан	SU1727533A3
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗИМОГЕННОЙ ФОРМЫ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО БЕЛКА С	1989	Бэнг Нильс Ульрик[Us] Эрлих Хармут Джозеф[De] Гриннелл Брайан Вилльям[Us] Ян Сау-Чи Бетти[Us]	RU2018535C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА ТКАНЕВОГО ТИПА, ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ СНО-ПРОДУЦЕНТ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА ТКАНЕВОГО ТИПА	1987	Давид Ваннорман Геддель[Us] Вильям Джэк Кор[Us] Диане Пенника[Us] Гордон Аллен Вехар[Us]	RU2046827C1
Рекомбинатные плазмиды- @ - @ ,кодирующие синтез лейкоцитарного интерферона типа @ - @ человека, и штаммы @ @ / @ - @ - @ -продуценты лейкоцитарного интерферона типа @ -F человека	1983	Овчинников Ю.А. Свердлов Е.Д. Монастырская Г.С. Царев С.А. Зайцева Е.М. Саломатина И.С. Чахмахчева О.Г. Ефимов В.А. Кузнецов В.П. Соловьев В.Д. Новохатский А.С. Аспетов Р.Д. Жданов В.М. Кавсан В.М.	SU1144376A1
Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pRH W11 или pRH W12, кодирующей омега-интерферон	1987	Рудольф Гауптманн Петер Мейндль Эва Растль-Дворкин Гюнтер Адольф Петер Светлы Кристиан Пилер Норберт Гауэль	SU1572419A3

Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pHTN 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека Советский патент 1990 года по МПК C12N15/28

Описание патента на изобретение SU1614765A3

Похожие патенты SU1614765A3

Реферат патента 1990 года Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pHTN 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека

Формула изобретения SU 1 614 765 A3

SU 1 614 765 A3