Способ получения аденозинтрифосфатазы Советский патент 1986 года по МПК C12N9/00 

Изобретение относится к медицине, именно к микробиологии.

Цель изобретения - упрощение способа за счет использования клеточного аутолиза.

Способ осуществляют следующим бразом.

Для получения аденозинтрифосфата- зы (АТФ-азы) используют холерный вибрион классического биовара, серовара наба, штамм 569 В.

Выращивают холерные вибрионы в реакторе-ферментере, затем инактиви- руют культуру 0,1%-ным мертиолатом. В присутствии мертиолата происходит аутолиз (разрушение клеток вибрионов) , в результате чего АТФ-аза выходит из клеточных мембран в культу- ральную жидкость, которая в дальнейшем служит источником фермента.

После аутолиза реакторную культуру центрифугируют для отделения ферментов разрущенньпс клеток при 4000-6000 g в течение 25-30 мин и из надосадка.

Через 16-18 ч сформировавшийся при высаливании осадок отделяют центрифугированием при 4000-6000 g в течение 15-20 мин, растворяют дистиллированной водой и обессоливают на колонке с акрилексом Р-60, элюируя ферментсодержащий белок 0,005 М грис -НСг буфером рН 7,6-7,8.

Обессоленный препарат, содержащий АТФ-азу, гель-хроматографируют на колонке с биогелем А-150 М. Элю- цИю проводят 0,005 М грис -HCI. буфером рН 7,5-8,0.

Все операции по выделению и очистке фермента проводят под контролем определения удельной активности. Степень очистки АТФ-азы составляет . 41,83 крат. Выход препарата фермента 1,5-2%.

Пример. Культуру vibrio cho- terae 569 В выращивают в течение 8- 10 ч в 250 л реакторе-ферментере в условиях аэрации при 34-36 С глубинным методом на бульоне из ферментированного гидролизата казеина рН8,0, содержащего, %: пептон 2; NaCf 0,5; 0,05; аминного азота 200мг.%.

Культивирование вибрионов продолжают до концентрации 55-65 млрд. микробных клеток в 1 мл, переносят реакторную культуру в бутыль емкостью 5 л и добавляют мертиолат (5 г сухого мертиолата растворяют в 20мл дистиллированной воды) таким образом.

5

чтобы его конечная концентрация составляла 0,1%.

Через ч реакторную культуру с внесенным мертиолатсм высевают на питательные среды для контроля специфической стерильности. Результат вы:сева учитывают в соответствии с режимом работы с особо опасными инфекциями через 8 сут. За это время при аутолизе АТФ-аза переходит из мембран вибрионов в культуральную жидкость, из которой в дальнейшем получают фермент.

После учета контроля, подтверждающего стерильность реакторной культуры, ее центрифугируют для отделения разрушенных аутолизом клеток при 4000-6000 g в течение 25-30 мин. Осадок, содержащий разрушенные клетки,, отбрасывают, надосадок, содержащий АТФ-азу, переносят в 10-л емкость и добавляют к нему сульфат аммония до 90% насыщения, растворяют перемешиванием и оставляют для формирования осадка при комнатной температуре на 16-18 ч.

Через 16-18 ч насыщенную сульфатом аммония культуральную жидкость центрифугируют для получения осадка 0 белка при 4000-6000 g в течение 15- 20 мин. Надосадок отбрасывают, а осадок, содержащий АТФ-азу, в объеме 0,25-0,3 л растворяют дистиллирован-- ной водой из расчета; 1 ч. осадка + 1 ч. воды. Растворенный осадок 0,5- 0,6 л фильтруют через бумажный фильтр и обессоливают на колонке с акрилексом Р-60. Для этого колонку размерами 45x500 мм наполняют гелем акрилек0

5

5

са Р-60 в объеме 1 л, уравновешенным

0,005 М трис -НС буфером рН 7,5-8,0. На гель наносят 0,5-0,6 л растворенного дистиллированной водой осадка и элюируют со скоростью 350-400 мл/ч.

Сбор элюата проводят под контролем оптической плотности при 380 нм с помощью проточной спектрофотометри- ческой кюветы.

Полученный препарат изучают на

содержание белка, полисахаридов, нуклеиновых кислот.

На заключительном этапе получения АТФ--азы применяют гель-хроматографию на колонке с биогелем А-150 М.

Для этого колонку размерами 15x300 мм наполняют биогелем А-150 в объеме 45 мл. уравновешенным 0,005 Мтрис - НСf. буфером рН 7,5-8,0, и наслаивают

на него 25-30 мл обессоленного ферментного раствора. Элюцию проводят со скоростью 40-50 мл/ч. Фракции по 3-4 мл собирают на автоматическом коллекторе. Каждую фракцию изучают на содержание белка (по поглощению длины волны при 280 нм и более объективно по методу Лоури) и на активность АТФ-азы. Об активности АТФ-азы судят по нарастанию концентрации не- органического фосфора PJ в инкубационной смеси, содержащей, М: NaC КСЕ 2-10, МпСЕ 5-10 ; АТФ-динатрие- вой соли (Р.еапа) IPHC-НСГ буфера 5 7,6.

Наряду с опытной пробой одновременно ставят две контрольные, одна из которых содержит все компоненты инкубационной смеси, но вместо раствора белка в нее вносят равный объем воды, другая содержит исследуемый белок, но вместо инкубационной смеси вносят воду.

Концентрацию неорганического фосфора определяют фотометрически по известному методу. Расчет увеличения содержания неорганического фосфора проводят вычитанием из концентрации Р/ опытной пробы суммы концентраций PJ двух контрольных проб. За едини- цу активности АТФ-азы принимают количество белка-фермента, которое споНасадок культуральной жидкости после отделения фрагментов клеток вибрионов 3

Обессоленный ферменсодержа- щий препарат

после элюции

на колонке с

биогелем

Р-60 4

после хроматографии на колонке с бирге- лем А-150 М 4

13,2+1,2 161,6+6,5 154,7+12,7

5,55+0,15412jf35,0 746j+76,34,82

0,308+0,08

283+154,3 6472+1311

41,83

собно за I ч инкубации при 37 С высвободить из АТФ I мкг неорганичет:ког фосфора. Путем отношения АТФ-азной активности к I/JO концентрации белка (так как в опытную пробу вносят 0,1 мл) рассчитывают удельную активность фермента. Результаты определения удельной активности АТФ-азы холерного вибриона на различных стадиях получения представлены в табл. 1

Из табл. 1 видно, что по сравнению с исходным материалом (надосад- ком культуральной жидкости после отделения фрагментов клеток вибрионов) при обессоливании на колонке с акрилексом Р-60 достигается 4,82-кратная очистка, при гельхрома- тографии на колонке с биогелем А-150 М - 41,83-кратная степень чистоты препарата.

Химический состав нативного и очищенного препаратов АТФ-азы представлен в табл. 2.

Из представленных в табл. 2 данных видно, что по сравнению с натив- ным препаратом конечный продукт - фермент АТФ-аза, содержит в 3,9 раза меньше нуклеиновых кислот и в 62,8 раза меньше полисахаридов в расчете на 1 мг белка. Вьгход фермента составляет 1,5-2%.

Таблица 1

283+154,3 6472+1311

41,83

13,,2 38,,4

рконов

(п-3)

(п-6)

Очищенный препарат фермента АТФ-азы холерного вибриона 0,308+0,08 0,23+0,009

(п-4)

(п«8)

Примечание. Содержание нуклеиновых кислот и полисахаридов в

надосадке культуральной жидкости после отделения фрагментов клеток вибриоиов принимают за 100%.

Редактор Н. Гунько

Составитель М. Позняк

Техред И.Попович Корректор М. Максимишинец

Заказ 2737/27Тираж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таблица 2

2,9371,7+35,7 28,2

(100%)() (100%)

0,740,,009 0,45

(25,4%)() (1,59%)