Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для лекарственного мониторинга при терапии теофиллином.
Штамм получают следующим образом.
Клетки мышиной миеломной линии Х63 Ад 8653 гибридизуют со соленоцитами мыши линии Balb/c, иммунизируют конъюги- рованныг антигеном теофиллина с гемоцианином.
Мышей иммунизируют 3-4 мес, периодически сыворотку животных анализируют на присутствие антител к теофиллину. Анализ осуществляют твердофазным иммуно- ферментным методом, в качестве антигена используют конъюгированный антиген теофиллина с человеческим сывороточным альбумином. У животных с высоким титром антител к теофиллину берут селезенку и выделяют из нее клетки для слияния. Миелом- ную линию Х63. Ад 8653 (стабильную миеломную линию, не секретирующую иммуноглобулины) выбирают в качестве второго партнера для слияния.
Слияние клеток проводят с использованием полиэтиленгликоля. Отношение числа селезеночных клеток к числу миеломных клеток варьируют от 5:1 до 1:1.
После слияния клетки разбавляют и культивируют в селективной среде, содержащей зминоптерин, гипоксантин и тими- дин, до появления растущих клонов.
Супернатанты анализируют твердофазным иммуноферментным методом, в качестве антигена используют коньюгат теофиллина с человеческим сывороточным альбумином, антитела обнаруживают с помощью кроличьих антител к IgG мыши, меченных пероксидазой хрена, так что выявляются только клоны, продуцирующие антитела класса G.
Дополнительный анализ синтезируемых антител производят по ингибированию тиофиллином и его аналогом связывания антител с сорбированным конъюгатом теофил(Л
С
о VJ
OJ СЛ Ч) VI
лин - человеческий сывороточный альбумин.
Положительные клоны повторно клонируют.
Из положительнгых клонов выбирают клон 2G34, продуцирующий антитела с минимальной перекрестной реактивностью по отношению к метаболитам и аналогам тео- филлина. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 367Д.
Клон продуцирует антитела, относящиеся к подклассу lgG2a.
Для получения больших количеств антител гибридные клетки вводят внутрибрюшинно мышам, предварительно сенсибилизирован- ным пристанем.
Антитела из асцитных жидкостей ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-цел- люлозе.
Полученные моноклональные антитела используют в иммуноферментном методе определения теофиллина.
Штамм характеризуется следующими признаками.
Культуральные свойства клона 2G34 ти- пичны для гибридом. Клетки культивируют в монослое в концентрации 5-10 клеток/мл, время субкультивирования составляет около 48 ч.
Продуктивность штамма. Штамм проду- цирует специфичные к теофиллину монАТ с концентрацией 5-8 мг/мл в асцитической жидкости.
Криоконсервирование. Криоконсерви- рование гибридомы 0существляют в смеси равных объемов среды RPM11640 и телячьей эмбриональной сыворотки, содержащей 15% диметилсульфоксида, по 10 клеток в ампуле. Первые 3 суток ампулы хранят при -70° С, затем переносят в жидкий азот. По- еле разглаживания не теряют своих ростовых свойств.
Характеристика моноклональных антител.
Антитела из асцитов выделяют солевым осаждением сульфатом аммония и последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюло- зе с использованием градиента 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,2, 0 - 0,5 М NaCI. Гомогенность выделенных антител прове-
ряют с помощью электрофореза в полиакри- ламидном геле в присутствии додецилсуль- фата натрия. Антитела, синтиезируемые клоном 2G34, относятся к подклассу G2a, что определено твердофазным иммунофер- ментным методом с использованием козьих антител, к подклассам мышиного иммурог- лобулина G, меченных пероксидазой.
Пример, Использование полученных моноклональных антител для иммунофер- ментного определения теофиллина в сыворотках крови.
Коныогированный антиген тео-г/а-ЧСА растворяют в 0.05М натрий карбонат-бикар- бонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 1 мкг/мл и сорбируют на полистироловых 96-луночных планшетах фирмы NUNK по 100 мкл на лунку при 4° С в течение ночи, затем твердую фазу отмывают 0,05% -ным раствором тритона Х-100 3 раза и 3 раза водой.
Аликвоты по 3 мкл из сывороток крови больных, получавших теофиллин, или лошадиной сыворотки, содержащие известное количество препарата, вносят в лунки планшета и добавляют по 100 мкл Ig-PO в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCI, 0,05% твин-20 и 0,2% БСА, концентрации 1,1 мг/мл, разведение 1:800. Смесь тщательно встряхивают, инкубируют 20 мин при комнатной температуре, твердую фазу отмывают и приливают раствор субстрата (4 мкл 30%-ного Н202 и 4 мг ор- тофенилендиамина на 100 мл 0,1 М натрий- цитратного буфера, рН 5,0), инкубируют 10 мин в темноте, детекция при 492 нм.
Специфичность антител, продуцируемых клоном 2G34, к теофиллину представлена в таблице.
Таким образом, использование монАТ позволит осуществлять контроль за концентрацией препарата в организме больного, индивидуальный подбор дозы теофиллина для лечения.
Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L., ВСКК(П) № 367Д, используемый для получения моноклональных антител к теофиллииу.
Вещество
Кофеин
Мочевая кислота
1-Метилмочевая кислота
1,3-Диметилмочевая кислота
Ксантин
Гипоксантин
3-Метилксантин
Аденозин
Отношение концентраций теофиллина родственною вещества, вызывающее
50 % -ное ингибирование, %
0.01
0.0001
10
5
0.0001 0.001 0,001 0,0001
Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для лекарственного мониторинга при терапии теофиллином. Штамм получают путем гибридизации спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных коньюгированным антигеном теофиллина с гемоцианином, с клетками миеломной линии Р3 - Х63. AG 8653. Клетки характеризуются свойствами, типичными для гибридом. Продуктивность штамма - 5 - 8 мг/мл монАТ в асцитической жидкости. МонАТ специфичны для теофиллина и относятся к классу IGG2a. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 367Д. 1 табл.
