Способ получения рестриктазы С @ I Советский патент 1990 года по МПК C12N9/14 

разца отсоединяется от колонки ДЭАЭ- сефацел.

Используемый штамм Caulobacter fu- siformis BC-25 получен из музея куль тур Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и хранится в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика под коллекционным номером ВКПМ B-2705

Caulobacter fusiformis BC-25 обладает морфологическими, культуральными и физиологическими признаками, характерными для всего рода Caulobacter: грамотрицательные, аэробы, низко- мезофильные хемогетеротрофы. В культуре Caulobacter fusiformis BC-25 присутствуют клетки трёх морфологически различных типов: жгутиковые, стебельковые и предделящиеся. Продолжитель- ность клеточного цикла не зависит от условий питания. Оптимальная температура роста 30°С. Культура хранится в пробирках, содержащих 50% питательной среды, на которой проводилось культи- вирование, и 50% глицерина при в течение 2 лет.

Отличительным признаком предлагаемого способа получения рестриктазы Cful является использование на первой стадии очистки фосфоцеллюлозы с элю- цией градиентом натрия хлористого 0,1-1,0 М, что обеспечивает отделение Cful от основной массы белков, нуклеиновых кислот, рестриктазы CfuII, ДНК-метилтрансфераз.

Другим существенным признаком является использование для очистки рестриктазы системы колонок ДЗАЭ-сефа цел-гепарин-сефарозы с нанесением образца при концентрации натрия хлористого 0,08-0,1 М, что обеспечивает сорбцию неспецифических ДНК-нуклеаз и фосфатазы на ДЭАЭ- сефацеле, а реет- риктазы Cful на гепарин-сефарозе, с которой фермент элюируется градиентом натрия хлористого 0,3-1,0 М.

Полученная рестриктаза Cful харак

теризуется следующими свойствами.

Узнает и специфически расщепляет только метилированные последовательности 5 Ст4А ТС (место расщепления указано стрелкой).

Оптимальное значение рН для дей- ствия рестриктазы 7,5-7,8.

Оптимальная концентрация NaCl 0-50 мм.

,

,,

0

5

Для проявления активности рестриктазы требуется Mg2, оптимальная концентрация 10-15 мм.

Пример . Получение рестриктазы Cful из Caulobacter fusiformis BC-25.

Последовательность операций.следующая .

Получение биомассы: поддерживание продуцента; выращивание посевного материала; культивирование штамма.

Выделение и очистка рестриктазы: разрушение клеток; хроматография на фосфоцеллюлозе; хроматография на колонках ДЭАЭ-сефацел-гепарин-сефарозы.

Для культивирования штамма и получения биомассы Caulobacter fusiformis BC-25 используют следующую аппаратуру: качалку S-25 New Brunswick, спектрофотометр СФ-26, бокс ламинарный, центрифугу Beckman I2-21.

Штамм Caulobacter fusiformis BC-25 поддерживают в пробирках на питательной среде, содержащей, г/л пептон 2,0-2,2; дрожжевой экстракт 1,0-1,2; MgSCU-THiO 0,2-0,22 и 50% глицерина при . Для оживления культуру пересевают в чашки Петри, содержащие среду следующего состава, г/л: пептон 2-2,2, дрожжевой экстракт 1,0-1,2, MgS04-7H10 0,2-0,22; агар 15-20, рН 6,8-7,0, и инкубируют в течение 4 сут при 28-30°С. Культуру,Caulobacter fusiformis BC-25 пересевают в колбы Эр- ленмейера с 200-250 мл питательной среды, содержащей, г/л: пептон 2,0- 2,2; дрожжевой экстракт 1,0-1,2; MgSQ, 7НаО 0,2-0,22 при рН 6,8-7,0. Клетки выращивают в термостатированной качалке при 250 об/мин, 28-30°С в течение Ц сут до оптической плотности OD , равной 1,9-2,1 опт. ед«

Затем клетки отделяют от культу- ральной жидкости центрифугированием. Полученную биомассу хранят при -20 С. Выход сырой биомассы составляет 1,7- 2,2 г/л питательной среды.

Для выделения и очистки рестриктазы используют следующую аппаратуру: ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-21, центрифугу Beckman I2-21, холодильный шкаф.- nini Cold Lab, хромато- графические колонки, термостат, аппарат для электрофореза, источник питания УИП-1, ультрафиолетовый осветитель.

ДНК pBR322 выделена по известной методике.

При разрушении клеток и хроматографии используют буферный раствор А: 0,01 М калий-фосфатный буфер, рН 7,, содержащий 0,005 М 2-меркап- тоэтанола, 0,001 М трилона В.

Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК pBR322 с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом агарозным гелем:|Q При 0,53-0,55 М NaCl, объединяют

485

х8 см). После нанесения образца колонки промывают 50 мл буфера А. Колонку с ДЭАЭ-сефацелем отсоединяют. Через колонку гепарин-сефарозы пропускают 20 мл буфера А, содержащего 0,3 М NaCl, и фермент элюируют градиентом 0, М фракции, содержащие рестриктазпую активность, элюируемые

Изобретение относится к биотехнологии, к способу получения фермента, специфически расщепляющего ДНК. Рестриктаза может быть использовано для исследования метилирования ДНК и в генетической инженерии. Целью изобретения является упрощение процесса очистки и повышение выхода целевого продукта. Культивирование продуцента CAULOBACTER FUSIFORMIS ВКПМ В-2705 (ВС-25) проводят на питательной среде, содержащей г/л: пептон 2,0

дрожжевой экстракт 1,0

MGSO₄^. 7H₂O 0,2 до оптической плотности OD₅₄₀, равной 1,9-2,1 о.е. Для выделения фермента клетки разрушают ультразвуком и очистку фермента из полученного бесклеточного экстракта проводят путем хроматографии на колонке фосфоцеллюлозы и системе колонок ДЭАЭ-сефацел-гепарин-сефароза с элюцией градиентом натрия хлористого 0,1-2 М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и 0,3-1 М на гепарин-сефарозе, которая после введения образца отсоединяется от колонки ДЭАЭ-сефацел.

реакционная смесь для гидролиза содержит 0,01 М трис-HCl буфер, рН 7,5 содержащих 0,01 М MgClj, 0,001 М ди- тиотрейтода, 2 мкг pBR322 и 1-5 мкл фермента в 40 мкл смеси. Реакцию про водят при 37°С в течение 1 ч.

Электрофорез проводят в 0,1 М нат рий-боратном буфере, рН 8,2, 0,002 м ЭДТА в течение 1 ч при напряжении 100 В. Окрашенные этидий бромидом (1 мкг/мл) гели просматривают в Уф- свете.

За условную единицу активности принимается то количество фермента, которое при 37°С в течение 1 ч дает специфическое фрагментирование субстрата, не изменяющееся при добавлении больших количеств рестриктазы.

Все операции по выделению и очистке фермента проводят при 4°С.

Разрушение клеток. 30 г биомассы, полученной при культивировании Caulo bacter fusiformis BC-25, суспендирую в 60 мл буфера А, содержащего 0,1 М NaCl, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе мощностью 300 Вт в течение 10 мин и центрифугируют при 20000 об/мин на центрифуге Бекман- Ж-21, ротор ЖА-20.

Хроматография на фосфоцеллюлозе. Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 30 мл/ч наносят на колонку (2,5x15 см) с фосфоцеллюлозой, уравновешенной буфером А, содержащим 0,1 М NaCl. Колонку промывают 60 мл этого же буфера и фермент элюируют градиентом NaCl от 0,1 до 1 М. Фракции, содержащие рестриктазную активность, элюируемые при 0,54-0,56 М NaCl, объединяют.

Хроматография на ДЭАЭ-сефацел- гепарин-сефарозе. Ферментный препарат, полученный на предыдущей стадии разводят буфером А до концентрации NaCl 0,1 М и со скоростью 70 мл/ч наносят на систему колонок, состоящую из колонки ДЭАЭ-сефацел (1,5х х8 см), соединенной последовательно с колонкой гепарин-сефарозы (1,5х

0

5

0

5

5

0

концентрируют против 0,01 М калий- фосфатного буфера, рН 7,4, 0,1 М NaCl, 0,001 М дитиотрейтол, 0,001 М ЭДТА, 50% глицерина (по объему) и хранят при -20°С-, Из 1 г биомассы получают 1000 единиц рестриктазы.

Предлагаемый способ обеспечивает получение высокоочищенного фермента, .соответствующего требованиям, предъявляемым к коммерческим препаратам рес- триктаз.

Преимуществом изобретения по сравнению с известным является его быстрота и -высокий выход фермента. Это достигается исключением всех стадий диализа и осаждения белка сульфатом аммония, а также использованием системы колонок ДЭАЭ-сефацел-гепарин- сефароза, которая позволяет получить очистку фермента на обоих сорбентах в одной стадии с максимальной скоростью и осуществить очистку рестриктазы Cful за два дня. Продолжительность очистки фермента по известному способу составляет не менее 6 дней. Сокращение до минимума числа операций и продолжительности выделения фермента позволяет повысить выход фермента от 50-60 до 1000 ед/г биомассы Caulobac- ter fusiformis BC-25.

0

Формула изобретения Способ получения рестриктазы Cful, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма,Caulo- bacter fusiformis ВКПМ В-2705 на питательной среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт, воду и сульфат магния, с последующим разрушением клеток ультразвуком и очисткой фермента путем хроматографии, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса очистки и повышения выхода целевого продукта, хроматографию ведут на колонке фосфоцеллюлозы с элюцией градиентом хлористого натрия от 0,1 до 1,0 М и затем на системе колонок ДЭАЭ-сефацел-гепарин-сефарозы с нанесением образца при концентрации

5

715W 858

хлористого натрия от 0,08 до 0,1 М енте хлористого натрия от 0,3 до и элюции с гепарин-сефарозы в гради- 1,0 М.