I
(21)4371270/30-13
(22)28.01.88
(46) 07.07.90. Бюл. № 25
(71)Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения
(72)Л.П.Евсеев, В.В.Евдокимов, В.В.Светличкин, А.В.Соколов
и К.М.Ледян
(53)577.15(088.8)
I
(56) Lam W.K.W. et al. Clin Chem, 1979, 25, F, 1285-1289.
(54)СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОЙ ФОС- ФАТАЗЫ
(57) Изобретение относится к биохимии и .медицине, касается выделения кислой фосфатазы и может быть использовано для создания иммунодиагностикумов. Целью изобретения является повышение удельной активности фермента. Способ заключается в следующем. Из эякулята получают спермоплазму путем центрифугирования. Затем кислую фосфатазу, содержащуюся в полученной спермоплазме, очищают хроматографией с последовательным использованием фенилсефарозы 4В,сефадекса G-200 и целлюлозы ДЕАЕ-52. Полученная таким образом кислая фосфатаза обладает удельной активностью до 1200 ед/мг.
с 9
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ получения простатической кислой фосфатазы | 1990 |
|
SU1747488A1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА КОЛЛАГЕНАЗЫ | 2003 |
|
RU2236460C1 |
| Способ получения @ - @ -галактозидазы | 1982 |
|
SU1082812A1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ B ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ СВИНЬИ | 2007 |
|
RU2354696C1 |
| СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ CU, ZN-СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ ЧЕЛОВЕКА | 1994 |
|
RU2111754C1 |
| Способ получения ( @ I)-кислой фосфатазы предстательной железы человека | 1990 |
|
SU1767434A1 |
| СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА БОТУЛИНИЧЕСКОГО ТОКСИНА ТИПА А | 2002 |
|
RU2230325C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА | 2012 |
|
RU2486240C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ HINF I | 1997 |
|
RU2136749C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ α -ГЛОБУЛИНА ПУЗЫРНОЙ ЖИДКОСТИ, АССОЦИИРОВАННОГО С ИСТИННОЙ ПУЗЫРЧАТКОЙ | 1993 |
|
RU2043117C1 |
Изобретение относится к биохимии и медицине, касается выделения кислой фосфатазы и может быть использовано для создания иммунодиагностикумов. Целью изобретения является повышение удельной активности фермента. Способ заключается в следующем. Из эякулята получают спермоплазму путем центрифугирования. Затем кислую фосфатазу, содержащуюся в полученной спермоплазме, очищают хроматографией с последовательным использованием фенилсефарозы 4В, сефадекса G-200 и целлюлозы ДЕАЕ-52. Полученная таким образом кислая фосфатаза обладает удельной активностью до 1200 ед/мг.
Изобретение относится к биохимии и медицине и касается выделения кислой фосфатазы и может быть использовано для создания иммунодиагностикумов.
Целью изобретения является повышение удельной активности фермента.
Способ заключается в следующем.
Из эякулята получают спермоплазму путем центрифугирования эякулята. Затем кислую фосфатазу, содержащуюся в полученной спермоплазме, очищают хро- мотографией с последовательным использованием фенилсефарозы 4В, сефа- декса G-200 и ДЕАЕ-52-целлюлозы. Центрифугирование позволяет отделить кислую фосфатазу от клеточного дебри- са и сконцентрировать кислую фосфатазу в малом объеме. Предлагаем последовательность операций очистки с использованием указанных наполнителей позволяет наиболее полно провести очистку кислой фосфатазы от сопутствующих белков. Полученная таким образом кислая фосфатаза обладает удельной активностью до 1200 ед/мг.
Пример 1. Берут 150 мл эякулята. Удельная активность кислой фосфатазы в общем объеме исходного материала составляет 4,3 МЕ/мл. Затем этот объем центрифугируют 15 мин при 3000 g для отделения спермоштазмы от клеточных элементов эякулята. Далее спермоплазму, содержащуюся в надоса- дочной жидкости, хроматографируют в колонке с фенилсефарозой CL-4B ( мм), уравновешенной Ш сернокислым аммонием в ацетатном буфере 0,005М, рН 5,0 с 0,15М хлористого натрия. Скорость элюции 15 мл/ч, фракции по 15 мл. Собранные фракции проверяют на содержание КПФ в иммуно- диффузионном анализе. Фракции, содержащие КПФ в области 0,2М (NH4)2SOt, концентрируют ультрафильтрацией на
ел
05
ел
О5 4ь
фильтре УМ-tO до 90 мл. Чистота препарата составляет около 90%.
Полученный материал хроматографи- руют в колонке с сефадексом G-200 150x1100 мм, уравновешенно ацетатным буфером 0,005М рН 5,0 с 0,15М хлористого натрия. Скорость элюции 15 мл/ч, фракции по 15 мл. Собранные фракции проверяют на содержание КПФ р иммунодиффузионном анализе. Этот материал имеет концентрацию белка 1,45мг/мл,а концентрация КПФ составят 1,3 мг/мл.
Таким образом, чистота препарата составляет около 90%. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Натрия выявляются несколько минорных компонентов (2-3), но иммунозация кроликов этим материалом позволяет получать хорошую моноспецифическую антисыворотку. Материал после гельфильтрации на сефадексе G-200 буфера, рН 7,4, вводят в колонку с ДЕАЕ-52-целлюлозы. Скорость элюции 30 мл/ч, фракции по Ю мл. Элюции проводят ступенчатым градиентом возрастающих концентраций хлористого натрия в трис-НС1 буфере, рН 7,4. КПФ обнаружена во фракциях, элюированных с колонки
5
0
5
0
0,1М раствором хлористого натрия. Эти фракции сливают вместе и проводят анализ. Концентрация белка в полученном материале 760 мкг/мл, а титр в тест-системе на КПФ V:800. Определяют концентрацию КПФ с помощью радиоиммунного анализа на простатическую кислую фосфатазу. КПФ составляет 760000 Полученная кислая фосфатаза обладает высокой удельной активностью до 1200 ед/мг.
Формула изобретения
Способ выделения кислой фосфатазы, предусматривающий получение эякулята, экстракцию из него суммарной белковой фракции и ее хромсграфическую очистку, о тличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности фермента, из эякулята перед его экстракцией выделяют спермоплазму центрифугированием, а хроматографи- ческую очистку проводят последовательно на фенилсефарозе GL-4B с элю- цией снижающимся градиентом сульфата аммония от 1 до О,1М9 на сефадексе G-200 и на целлюлозе ДЕ-52 - с элюци- ей возрастающим градиентом хлористого натрия от 0,05 до 1М.
