Ингибитор фермента моноаминооксидазы Советский патент 1990 года по МПК C07C251/02 C12N9/04 

ЈЛ ч

Изобретение относится к биологическим активным соединениям, а именно к бензилиденаминоэтанолам общей формулы (X) C 6H 4CH=NCH 2CH 2OH, где X - M - NO 2 (I), P - NO 2(II), P - N(CH 3) 2(III), в качестве ингибиторов фермента моноаминооксидазы. Цель изобретения - выявление соединения ряда оснований шиффа, имеющего N - β - оксиэтильную группу и обладающего повышенной ингибирующей активностью по отношению к моноаминооксидазе и низкой токсичностью. На разных видах животных (белые мыши, крысы, бык, глухарь) показано, что соединение I-III являются эффективными ингибиторами дезаминирования серотонина и бензиламина в печени и мозге в опытах IN VIVO и IN VITRO. Эффективность ингибирования достигает 85% при концентрации 13 мкМ. На примере препарата I показано, что ЛД 50 составляет 1563 мг/кг, т.е.препарат является малотоксичным. Соединения могут найти применение в медицине в качестве антидепрессантов. 5 табл.

Изобретение относится к биологически активным соединениям, а именно к бензшшденаминоэтанолам общей формулы

CH NCH2CH2OH

где X - И - Ш0г (I); n - Н0г (II);

n - H(CHs)a (III). Цель изобретения - выявление соединения ряда основании Шиффа, имеющего N - д -оксиэтильную группу и обладающего повышенной ингибирующей активностью по отношению к моноаминооксидазе и низкой токсичностью. В качестве ингибитора моноаминооксидазы используют замещенные Ы-бензилиденамино- этанолы, синтез которых- осуществляется в одной стадии с использованием коммерчески доступных исходных соединений.

Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. 2-(/ -Нитробензилиден)аминоэтанол (I).

Получен кипячением 30,5 г (0,5 моль) моноэтаноламина, 75,5 г (0,5 моль) „м--нитробензальдегида, 1 г п-толуолсульфокислоты (катализаЈ71

31578125

тор) в 200 мл толуола с азеотропной отгонкой воды. Кристаллическую массу, образующуюся по охлаждении реакционной смеси, перекристаллизовывают из толуола. Получают 80,0 г (82,0 %) соединения (I).

Желтоватые кристаллы с т.пл, 69 71°С.

Серия 1. Берут свежий или свежезамороженный кусочек ткани печени быка, промывают ее холодной дистилл рованной водой от крови, просушивают между листами фильтровальной бум ги, отвешивают на технических весах навеску, например 5 г, которую зате

помещают в чашку Петри, стоящую на Найдено,%: С 55,30; 55,41; Н 5,01;tg льду, измельчают навеску ножницами

5,23; N 14,22; 14,38.

C3HfoK pj.

Вычислено,%: С 55,67; N 14,42.

Н 5,19;

и кусочки ткани печени помещают в охлаждаемый льдом гомогенизатор типа МР-302, в который, кроме того, доливают двойное количество 0,2 М фосфатИК-спектр, 34 (-ОН связ. )js ного буфера рН 7,4, т.е. 10 мл. Го1660 (С N), 1360 (сим. Ы02).

П р и м е р 2. 2-(п Нитробензили- ден)аминоэтанол (II).

Получен аналогично примеру 1 из 11,0 г (0,18 моль) моноэтаноламина, 27,2 г (0,18 моль) п-нитробензальде- гида, 0,5 г n-толуолсульфокислоты в 100 мл толуола. Выход 18,0 г (51,5%).

Желтоватые игольчатые кристаллы с т.пл. 80 - 82°С.

Найдено,%: С 55,55; 55,07; Н 5,12; 5,08; N 14,30; 14,35.

С9Н foH403

Вычислено,%: С 55,67; Н 5,19; N .

ПМР-спектр, J1, м.д.: 2,60 (l H, ОН); 3,86 т (2 Н, ); 3,98 т (2 Н, СН40), 7,88-8,32 к (4 Н, п-С6Н4), 8,45 с (1 Н, ).

20

могенизируют печень в фосфатном буфере 1,5 мин на холоду. Полученный гомогенат разливают в 3 круглодонные склянки на 50 мл. Одна склянка служит в качестве холостой, вторая - контрольной, третья - опытнойо В каждую склянку приливают по 1 мл фосфатного буфера и по 1 мл гомогената.Кроме того, в контрольную и опытную склянки добавляют субстрат - серотонин в виде креатинин сульфата 3,2 мг или бензиламин гидрохлорид 5,7 мг. В опытную склянку в отличие от контрольной добавляют ингибитор, раствор 30 которого готовят следующим образом: 2,5 мг препарата - ингибитора (l), (II) или (III) растворяют в 1 мл фосфатного буфера, берут 0,1 мл этого раствора и помещают в пробы,наз25

Пример 3. 2-(п-Диметиламино- 35 ванные выше опытными. Для получения бензилиден)аминоэтанол (ill).концентрации ингибитора в 10 раз

Получен аналогично примеру 1 из 30,5 г (0,5 моль) моноэтаноламина,

44,6 г (0,5 моль) п-диметиламинобенменьшей навеску ингибитора на: аналитических весах 2,5 мг растворяют в 10 мл фосфатного буфера, В холостую зальдегида, 1 г п-толуолсульфокисло- 40 и контрольную пробы добавляют фос- ты в 150 мл толуола. Выход 78,8 гфатный буфер в количестве 0,1 ми для

(82,0 %).выравнивания объемов так, что конечТемно-кремовые кристаллы с т.пл.ный объем в пробах составляет 2,1 мть

105 - 106°С.Все склянки помещают в аппарат

Найдено,%: С 68,42; 68,66; Н 8,31;д5 Варбурга, где они встряхиваются при 8,11; N 14,29, 14,57.

CttHuH40 Вычислено,%: И 14,57.

ПМР-спектр,

С 68,72; Н 8,39; с . м.д

38 С в течение 50 мин. Затем белки в пробах осаждают 2 мл 24%-ной хлорной кислоты, центрифугируют и 0,2 мл надосадочной жидкости используют для „, 2,92 с 6 Н,с0 анализа аммиака по методу Кснвея.Из

каждой пробы перекосят по мл супернатанта во внешнюю часть трех чашек Конвея.

Серия 2. После приливания 0,2 мл П р и м е р 4. Исследование nperta 55 супернатанта во внешнюю часть чашек

(СНэ)г, 3,64 т (2 Н, CH7N),3,84 т (2 Н, СЯ40), 4,38 с (I H, ОН), 6,59 - 7,61 к (4 Н, п-С,Н4), 8,10 с (1 Н, СН Ы).

ратов (l), (ll), (Ш) на окислительное дезамивирование серотонина и бензиламина в гомогенатах печени крупного рогатого скота в опытах.

Конвея в противоположный конец наливают 10%-ный раствор едкого натрия, В центральной части чашек Конвея заранее наливают 0,001 н„ раствор

Серия 1. Берут свежий или свежезамороженный кусочек ткани печени быка, промывают ее холодной дистиллированной водой от крови, просушивают между листами фильтровальной бумаги, отвешивают на технических весах навеску, например 5 г, которую затем

и кусочки ткани печени помещают в охлаждаемый льдом гомогенизатор типа МР-302, в который, кроме того, доливают двойное количество 0,2 М фосфат ного буфера рН 7,4, т.е. 10 мл. Го0

могенизируют печень в фосфатном буфере 1,5 мин на холоду. Полученный гомогенат разливают в 3 круглодонные склянки на 50 мл. Одна склянка служит в качестве холостой, вторая - контрольной, третья - опытнойо В каждую склянку приливают по 1 мл фосфатного буфера и по 1 мл гомогената.Кроме того, в контрольную и опытную склянки добавляют субстрат - серотонин в виде креатинин сульфата 3,2 мг или бензиламин гидрохлорид 5,7 мг. В опытную склянку в отличие от контрольной добавляют ингибитор, раствор 0 которого готовят следующим образом: 2,5 мг препарата - ингибитора (l), (II) или (III) растворяют в 1 мл фосфатного буфера, берут 0,1 мл этого раствора и помещают в пробы,наз5

Конвея в противоположный конец наливают 10%-ный раствор едкого натрия, В центральной части чашек Конвея заранее наливают 0,001 н„ раствор

соляной кислоты. Чашки закрывают герметически стеклом, перемешивают содержимое из внешней части и оставляют до утра следующего дня: на 18ч, при комнатной температуре. Потом открывают чашки и титруют остаток соляной кислоты, не связавшийся с аммиаком, 0,001 н. раствором едкого натрия в присутствии смешанного индикатора: на 2 части 0,1%-ного раствора метиленового красного 1 часть 0,1%-ного раствора метиленового синего. Расчет производят по формуле: (а - в).10, где а - количество едкого натрия, пошедшего на титрование холостой пробы, мл; в - количество едкого натрия, пошедшего на титрование контрольной или опытной проб,мл. Разницу умножают на 10, чтобы учесть разведение и пересчитывают на 100 мг сухого гомогената ткани печени.

Чтобы получить сухой гомогенат ткани органа, в предварительно взвешенный бюкс помещают 1 мл гомогена- та, приготовленного так, как описано выше. Незакрытый бюкс ставят в сушильный шкаф и высушивают гомогенат при 80°С до постоянного веса. Сухой ткани в бюксе оказывается 50 - 80 мг, но результат, полученный после титрования в мкмоль аммиака рассчитывают на 100 мг веса сухого гомогената.

В контрольной пробе с субстратом серотонином аммиака выделилось 9,8 мкмоль на 100 мг сухого гомогената ткани печени быка, а в опытной пробе (с ингибитором) в присутствии препарата (l) значительно меньше: 4,9 мкмоль аммиака на 100 мг сухого гомогената ткани. Процент ин- гибирования, следовательно, составляет 50% (см. табл.1).

Аналогично проведены опыты с препаратами Б-2 и Б-3. Судя по снижению количества выделившегося аммиака в опытных пробах по сравнению с контрольными ингибирование дезаминиро- вания серотонина высокое 43,9 92,9%.

Если вместо серотонина в аналогичных опытах берется субстрат бензил- амин, то при добавлении препаратов (I), (II) и (III) в опытные пробы также наблюдается уменьшение дезами- нирования бензиламина, и процент ингибирования с дозой 1,3-10 М находится в пределах 55,5 - 76,3%,

но в концентрации 1, препараты I и III не эффективны как ингибиторы дезаминирования бензиламина, и процент ингибирования - от .0 до 6,6%. Тогда как препарат II - структурный изомер (I) - и в меньшей концентрации активно тормозит деза- минирование бензиламина: на 58,4%.

Пример5. Исследование влияния диализа на торможение дезаминирования серотонина в гомогенатах печени быка в присутствии ингибиторов (I), (II) и (III).

Берут гомогенат, приготовленный,

как описано в примере 4, серия 1, наливают I -мл его в пеницилиновую склянку, куда также добавляют по 0,1 мл ингибитора (концентрация 1,3х

0 х ), Отверстие в склянке завязывают целлофаном. Склянку укрепляют вверх дном в сосуде, заполненном 0,2 М раствором фосфатного буфера, и помещают этот сосуд в холодильник,

5 Буферный раствор в склянке время от времени меняют свежими порциями охлажденного фосфатного буфера. Через 2 сут вынимают склянки и их содержимое центрифугируют на холоду (не вы0 ше 4°С). К осадку гомогената добавляют 1 мл фосфатного буфера, субстрат серотонин и пробы инкубируют как описано в примере 4, серия 1, В аналогичных условиях 2 сут в процессе диализа находится гомогенат, который затем идет на холостые и контрольные опыты, В итоге сравнивают, сколько аммиака выделяется в диализируемых пробах с ингибиторами и без ингибито0 Р°в и пересчитывают на 100 мг веса.

Найдено: в контроле 4,7+0,1 мкмоль аммиака на 100 мг веса ткани, в опыте с ингибиторами: (I) - 0,21 tO,03 мкмоль, (II) - 2,5±0,2 мкмоль,

5 (Ш) - l,6iO,2 на 100 мг веса сухой ткани гомогената. Процент ингибирования после диализа составляет соответственно 47,3; 46,8; 66,0 % (табл.2). Следовательно, икгибирова0 ние дезаминирования серотонина в го- могенатах печени быка сохраняется и после диализа, так как восстановление активности дезаминирующего фермента не происходит (табл.2),

5 Примерб. Исследование влияния препаратов (I), (ll), (ill) и ни- аламида на окислительное дезаминиро- вание серотонина и бензиламина в го- могенатах печени глухаря.

В аналогичных условиях, которые описаны в примере 4, исследовано де- заминирование бензиламина (табл.З) и серотонина (табл.4) в гомогенатах Печени глухаря в присутствии прела- ратов (I), (II), (III) и ниаламида, Последний взят для сравнения как известный ингибитор моноаминооксидазы, дезаминирующей серотонин и бензил- амин. Опыты проведены in vitro также, как с гомогенатами печени быка (при- Мер 4). Ниаламид вносится в пробы следующим образом: 3,9 мг растворя- в 1 мл фосфатного буфера или в

JO мл в зависимости от применяемой концентрации и помещают в склянки по 0,1 мл.

Результаты приведены в табл. 3 и 4. Все три препарата(l), (ll), (ill) i каждой из исследованных концентраций угнетают дезаминирование серотонина и бензиламина. Эффект ингибиро- &ания не является зависимым пропорционально концентрации препаратов. Наиболее активно соединение (III), которое угнетает дезаминирование се рототина на 65 %, а бензчламина - на 85 %. Практически такими же по Эффективности являются соединения

В-1 и Б-2. Они угнетают цезаминиро- Јание бензиламина на 64 - 83%, Все три препарата (I), (II) и (ill) Проявляют большой ингибирующий эффект в отношении дезаминирования бен- зиламина в печени птиц по сравнению с серотонином. Особенно это характерно для препарата (ill), который в обеих наследованных концентрациях тормозит дезаминирование серотонина на 83 - 85%.

Пример 7. Исследование влияния препарата п-нитробензилиденамино- этанола (Б-2) на дезаминирование серотонина в гомогенатах печени и моз- га мышей.

Серия 1 . Препарат п-нитробензили- денаминоэтанол (II) вводится в дозе 200 мг/кг, составляющей 7,8 от суточной для него. Мыши взяты массой тела 19 - 23 г. Поэтому, например, мыши с массой тела 19 г получали 3,8 мг, ас массой тела 23 г - 4,6 кг препарата в ну трибрюшинно, рас творенного в 1 мл дистиллированной воде. Контрольным машам одновременно вводят дистиллированную воду также в количестве 1 мл. Через 18 ч после введения препаратов и воды мышей зад

0 5 0

г Q

5

-Q

5

Г

бивают декапитированием. Немедленно на холоду извлекают мозг и печень. Затем из тканей этих органов получают гомогенаты, которые проводят через все процедурыj предусмотренные методикой и описанные в примере 4.

Результаты приведены в табл.5.

В пробах с гомогенатами печени опытных мышей выделяется аммиака 0,34 мкмоль, а в контрольных - 5,5 мкмоль аммиака на 100 мг веса сухой ткани гомогената. В пробах с гомогенатами мозга с препаратом Б-2 найдено 1,7 мкмоль, а в контрольных - 16,2 мкмоль, что составляет 90%тор- можения дезаминирования серототина.

Серия 2. Исследование влияния препарата Б-2 на 5-окситриптофановый (5-01Ф) гиперкинезе. Берут контрольных и опытных мышей массой тела 6 - 25 г и всем вводят 5-ОТФ 50 мг/кг внутрибрюшинно. Опытные отличаются от контрольных тем, что за 2 ч до 5-ОТФ получали препарат Б-2 в дозе 200 мг/кг массы тела. Через 15 мин после введения 5-ОТФ подсчитывают количество встряхивающих движений головой у мышей в опыте и контроле.

Количество встряхивающих движений головой у мышей в контроле в среднем на 1 мышь (из 50) составляет 0,6, т.е. не все мыши в ответ на введение 5-ОТФ производят движение головой,

У опытных мышей эффект 5-ОТФ значительно потенциирует и составляет в среднем 11,6 движений на 1 мышь из трех. Следовательно, препарат Б-2 предотвращает разрушение серотонина в мозге, который образуется от 5-ОТФ in vivo.

Примерб. Определение токсичности препарата на примере препарата (I). Препарат суспензируют в крахмальном клейстере и вводят мышам per os шприцем с инъекционной иглой с булавовидным утолщением на конце. Варьируют дозы 1000 - 2500 мг/кг в сериях из 8 мышей.

Результат: ЛДЛ препарата (l) составляет 1563 мг/кг, т.е. препарат является нетоксичным.

Формула изобретения

Применение замещенных бензилиден- аминоэтанолов общей формулы

91578125Ю

(X) CtHaCK NCH2CHtOH,-в качестве ингибиторов фермента могде х - га-К02; P-N02 и р-ЩСНэ)гноаминооксидазы.

Влияние препарата на окислительное дезаминирование серотонина и бензиламина в гомогенатах печени крупного рогатого скота

.

Примечани е. Концентрация субстратов - 4 х . Над чертой

опыты с ингибитором, а под чертой - контроль (без ингибитора). Приведены значения Ml m; п 3 - 5 опытов; п 2.

Таблица2

Влияние диализа на окислительное дезаминирование серотонина гомогенатами печени быка в присутствии ингибиторов

Примечание. Приведены средние величины

Mfm; количество опытов равно 3.

Таблица

и

157812512

ТаблицаЗ

Влияние препаратов на разрушение бензиламина гомогенатами печени глухаря (Tetrao urogallus)

римечание. Приведены средние значения Mim,выражающие степень торможения разрушения субстрата под влиянием препарата (над чертой) по сравнению с контролем (под чертой). Количество опытов 3,

Таблица4

Влияние препаратов на разрушение серотонина гомогенатами п-ечени глухаря (Tetrao urogallus)

13

Угнетение активности моноаминооксидазы мкмоль%

1,3 х КГ 1,3 х 105 1,3 х 101,3 х 10

-5

i 0Х01 4,4Тб,оГ

2А2 ±0Л01 5,,09

4Л6 0А02 5,,03

3А5 ± 0Л(Н 5,,03

Таблица5

Влияние препарата (II) на дезаминирование серотонина в гомо- генатах печени и мозга мышей в опытах in vivo через 18 ч после введения в дозе 200 мг/кг внутрибрклшнно

Разрушение серотонина,мкмоль на 100 мг сухого гомогената, и его угнетение, %: М + т

в печенив мозге

Опыт I Контроль I % угнетения ОпытКонтроль I % угнетения

0,3410,2 5,510,294,0±0,15 1,7 + 0,7 16,2±2,690,017,8

n 13п 3

Таблицаб

Влияние препарата (II) на 5-окси- триптофановый гиперкинез

Количество встряхивающих движений головой у мышей после введения 5-окситриптофана (50 мг/кг) и совместно с препаратом (200 мг/кг) внутрибрюшинно (Mtm)

«.««««WM.M -.«...-....««.-

5-ОТФ (контроль) 5-ОТФ + препарат (II)

0,6 + 0,0611,6+0,7

n - 50n 3

Составитель А.Семенов Редактор Т.ЛазоренкоТехред Л.СердюковаКорректор т.Малец

Заказ 1888Тираж 336Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

157812514

Продолжение табл.4

55,56t 0,69 59,26t 0,74 28,58t 0,42 37,5010,50