Способ культивирования тучных клеток Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для исследования процессов гемопоэза.

Целью изобретения является повышение выхода клеток.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование тучных клеток из клеток-предшественников гемопоээа крысы.

Способ осуществляют на 10 крысах самцах популяции Вистар массой 160- 180 г, 20 мышах линии СВА массой 25- 40 г.

После дачи наркоза у крысы выделяют бедренную кость. Один конец кости скусывают,а другой протыкают толстой

иглой по оси кости и вымывают костный мозг средой 199. После ресуспендирования чер,ез набор игл с уменьшающимся диаметром в 2 мл среды 199 взвесь центрифугируют при 400 g (1500 об/мин) в

течение 10 мин. Затем надосадочную жидкость сливают, добавляют 2 мл среды 199 и манипуляцию повторяют.

Надосадочную жидкость убирают, добавляют 1,2 мл среды 199, ресуспен- дируют и фильтруют, пропуская через иглу с фильтром из четырех слоев капроновой сеточки. Полученный фильтрат наслаивают на градиент плотности фи- колл-верографин (плотность р 1077кг/л) и центрифугируют 8 мин при 400 g/

/1500 об/мин. Затем длинной иглой со шприцем отсасывают белесое облачко

(пуговица - 1 мл, которое образуют мононуклеары на границе градиента плотности и взвеси клеток. Подсчет клеток-предшественников на жизнеспособность производят с использованием фазовоконтрастной микроскопии (объектив 20, окуляр 10) в камере Горяева. Полученные клетки-предшественники из костного мозга крысы в стерильном боксе оставляют на адгезию на 30 мин.

(/

ел

00

со оз

В шприц емкостью 1 мл набирают клеток (обычно это количество находится в 0,1-0,2 мл взвеси моно- нуклеаров), добавляют к ним 40 ед. гепарина (на физрастворе) и доводят объем взвеси с гепарином до 1 мл плазмой животного. Вся манипуляция (получение взвеси клеток с гепарином) занимает 3 мин, а контакт клеток-предшественников с гепарином (до разведения плазмы) длится от одной до 3-х мин.

Полученной взвесью (гепарин + клетки) заполняют диффузионные микрокаме- ры путем прокола одного из торцов камеры. Место прокола промакивают сухой Марлевой салфеткой и закреливают клеем БФ-6. Заклеенные камеры помещают в одноразовые чашки Петри, каждую камеру (по 5 камер в одну чашку) - в каплю со средой 199.

После заполнения камеры имплантируют в брюхо мыши путем прокола иглой диаметром 3 мм. Камеры вводят через иглу - по 5 камер в одну мышь.

Через 14 сут культивирования камеры извлекают из брюшной полости животного. Один торец камеры срезают бритвой и содержимое камеры выдавливают на предметное стекло, ведя камерой вдоль (по длине) стекла, чтобы мазок получился в виде дорожки. Мазки Просушивают и фиксируют метанолом. бкраску мазков производят по Романов- скому-Гимза, Паппенгейму, а с цепью идентификации тучных клеток - толуиди новым синим.

Для контроля имплантируют камеры, Заполненные взвесью клеток с физраствором и без не-го.

Затем проводят морфологическую идентификацию колоний методом микроскопии.

Качественная характеристика колоний в контроле (контроль 1 с физраст- вором и контроль 2 без него) - всего 20 камер - носит один и тот же характер и составляет: гранулоцетарные колонии 23,7%, макрофагальные 45,8%, смешанные (гранулоцитарно-макрофа- альные) 30,5%. Колоний тучных клеток ч мазках с контролем обнаружено не

было.

В мазках с гепарином (всего 30 камер) 92% составляют тучные клетки, 8% макрофаги.

Пример 2. Культивирование тучных клеток из клеток-предшественников периферической крови человека.

Q

0

5

5 0

$

0

5

0

В центрифужную пробирку с 3 мл раствора Оловера добавляют 5 мл свежей цельной крови из локтевой вены человека; осторожно перемешивают стерильной стеклянной палочкой. Полученную смесь центрифугируют при 400 g (1500 об/мин.) в течение 30 мин до тех пор, пока смесь плазма-антикоагулянт не станет прозрачной. На границе плазма-эритроциты образовывается лейкопленка. Затем плазму отсасывают длинной иглой со шприцем, не доходя при этом 1-2 мл до лейкопленки, и помещают в стерильный бокс (для дальнейшего использования при приготовлении взвеси клеток). Затем отсасывают лейкопленку, стараясь меньше захватить красной крови (объем 1 мл), и помещают ее (наслаивают) на градиент плотности фи- колл-верографин (плотность р 1,077 кг/л). Длинной иглой со шприцем отсасывают белесое облачко (1 мл), образованное мононуклеарами на границе градиента плотности и взвеси клеток. Подсчет клеток-предшественников на жизнеспособность производят в камере Горяезза фазовоконтрастной микроскопией.

Оставляют в течение 30 мин полученные клетки-предшественники в стерильном боксе.

В шприц (емкость 1 мл) набирают 1 «10 клеток, добавляют к ним 100 ед гепарина (на физиологическом растворе) , доводят объем взвеси с гепарином до 1 мл плазмой. Полученной взвесью с гепарином + клетки заполняют диффузионные микрокамеры. Заклеенные микрокамеры помещают в чашки Петри со средой 199. Заполненные микрокамеры с помощью длинной иглы диаметром 3 мм имплантируют в брюшную полость мышей (по 5 камер в 1 животное).

Всего имплантируют 20 камер с физраствором и без него (контроль 1 и 2) и 30 камер с гепарином. На 14 сут- ки камеры извлекают из брюшной полости животных. Содержимое камеры выдавливают на предметное стекло, получая мазок в виде дорожки. Мазки просушивают и фиксируют метанолом. Окраску мазков производят по Рамоновскому- Гимза, Паппенгейму, толуоидиновым синим.

Проводят морфологическую идентификацию колоний методом микроскопии,

5 1578193

Качественная характеристика коло- ведении научных исследований на туч- иий в контроле (1 и 2) - всего 20 ных клетках.

камер - носит один и тот же характер Формула изобретения и составляет: грануилоцитарные 20%, .1 , Способ культивирования тучных макрофагальные 53,3%, смешанные 26,7%. клеток, включающий получение взвеси В мазках с гепарином (всего 30 ка- клеток-предшественников с последую- мер) 100% составляют тучные клетки. Шей их инкубацией, о т л и ч а го- Использование предлагаемого спосо- щ и и с я тем, что, с целью повыше- ба позволяет повысить выход клеточ- ю ния вых°Да клеток, перед инкубацией ной массы, улучйить пролиферативные к взвеси клеток добавляют гепарин свойства культивируемых клеток, а в дозе 40-100 Ед/мл, а инкубацию также упростить процесс культивиро- осуществляют в диффузионной камере, вания. Способ перспективен при про- помещенной в брюшную полость животного.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для исследования процессов гемопоэза. Цель изобретения - повышение выхода клеток. К взвеси клеток - предшественников перед инкубацией вводят гепарин в дозе 40-100 ед/мл взвеси. Инкубацию смеси осуществляют в течение 10-14 дней в диффузионной камере, помещенной в брюшную полость лабораторного животного. При посадочной дозе 5 .10 5 кл/мл выход жизнеспособных тучных клеток составляет 2 .10 4 кл/мл (2 .10 3 кл/камеру).