Стимулятор индукции перитонеальных макрофагов для экспериментального животного Советский патент 1992 года по МПК G09B23/28 

1

(21)4838673/14 (22) 13.06.90 (46)07.10.92. Бюл. №37

(71)Институт иммунологии

(72)З.А.Макарян

(56)Keller R - Brit, J. Cancer, 1974, 30, 40.

(54) СТИМУЛЯТОР ИНДУКЦИИ ПЕРИТО- НЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЖИВОТНОГО

(57)Изобретение касается состава стимулятора индукции перитонеальных макрофагов. Цель изобретения - усиление индукции

перитонеальных макрофагов, Состав представляет смесь следующих ингредиентов, об.% гель гидроокиси алюминия 17-23; 20%-ный раствор поливинилпирролидона с молекулярной массой 280-360 килодальтон 16-24; 10%-ный раствор кальция хлорида 8-12; 10%-ный раствор пепсина 4-6; 0,25%- ный раствор трипсина (100-128 единиц) коммерческий 55-35. При введении мышам индуктора на 10 суток после введения возрастет по сравнению с прототипом количество перитонеальных макрофагов в 2-2,7 раза.

Изобретение относится к медицине, биологии и ветеринарии, а именно к способам, повышающим уровень индукции перитонеальных макрофагов и может быть использовано в различных иммунологических исследованиях, где находят применение пе- ритонеальные макрофаги,

Известно множество стимуляторов для получения перитонеальных макрофагов (ПМФ). Для увеличения сбора клеток используют различные вещества, введенные внутрибрюшинно и вызывающие в брюшной полости лабораторных животных стерильный экссудативный процесс. С этой целью применяют мясо-пептонный, казеиновый или комбинированный бульон, тиог- ликоллятовую среду, крахмал, минеральное масло, гликоген, неполный адъювант Фрей- нда.

Однако выход ПМФ, получаемых с помощью известных ирритантов незначителен, при этом требуется длительное время для их выделения.

Наиболее активным из известных ирритантов для стимуляции индукции перитонеальных макрофагов (ПМФ) является 2-10%- ный раствор пептона. Способ его применения заключается в выполнении следующих операций: полученную навеску пептона растворяют в дистиллированной воде и при по- стоянном перемешивании доводят до кипения. При остывании раствора пептона до 35-37°С, стерильным шприцем осуществляют интраперитонеальное введение.

После применения ирританта на 3-4 сутки осуществляют получение ПМФ следующим образом: после умерщвления животного, внутрибрюшинно вводят среду М 199 или раствор Хенкса, содержащие 5-20 ед/мл гепарина. Объем жидкости, используемой для промывания брюшной полости, зависит также от вида животных: для мышей он составляет 2-5 мл, для крыс и морских свинок - 10-20 мл, для кролика - более 200 мл, Полученный смыв перитонеального экссудата помещают на стерильные пластиковые чашки Петри, При этом ПМФ прикрепляются к поверхности пластика через 30-60 минут, после чего культуральную среду удаляют и заменяют на среду № 199 с 10% сыворотки

(Л

С

о

4 СЛ

4

крупного рогатого скота для получения роста ПМФ. Полученную культуру ПМФ далее используют в зависимости от поставленных целей исследования.

Однако использование 2-10%-ного раствора пептона не обеспечивает быстрого и значительного стимулирования индукции ПМФ.

Целью изобретения является усиление индукции перитонеальных макрофагов и сокращение времени их выработки.

Получают предлагаемый состав следующим образом: предварительно готовят водные растворы поливинилпирролидона, хлорида кальция и пепсина, для чего 20 г поливинилпирролидона (фирма Mere) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, 10 г хлорида кальция также растворяют в 100 мл воды и 10 г пепсина (коммерческий порошок) растворяют в 100 мл теплой воды. Затем проводят смешение всех жидких компонентов в количествах, указанных в формуле изобретения. При этом получают опалесцирующую жидкость, которую затем стерилизуют автоклавированием при 1,5 атм в течение 30 мин. Срок хранения 12-18 месяцев при +3...+5°С.

Таким образом были получены следующие составы:

Состав I,

гель гидроокиси алюминия17 мл (014 мг/мл) коммерческий, выпускается предприятием вакцин и сывороток, Петрово-Дальнее . 20%-ный водный раствор поливинилпирролидона, М.м 280000 16 мл 10%-ный раствор хлорида8 мл 10%-ный раствор пепсина4 мл 0,25%-ны раств«р трипсина до 100 мл оммерческий, 100 ЕД, выпускается Мосовским предприятием по производству актерийный препаратов

Состав II.

гель гидроокиси алюминия23 мл (0,14 мг/мл) коммер- . ческий 20%-ный водный раствор поливинилпирролидона

М.м. 36 000024 мл

10%-ный раствор кальция хлорида12 мл 10%-ный водный раствор пепсина6 мл 0,25%-ный раствор

трипсина 128 ЕД коммерческийдо 100 мл

0

5

20мл

20 мл

10мл

5 мл

Состав III.

гель гидроокиси алюминия

(0,14 мг/мл) коммерческий 20%-ный водный раствор поливинилпирролидонаМ.м. 300000 10%-ный раствор кальция хлорида 10%-ный водный раствор пепсина 0,25%-ный раствор трипсина 110ЕДдо 110 мл.

Применяют вышеуказанные составы следующим образом: перед введением ир- Q ританта состав взбалтывают, набирают в стерильный шприц и проводят внутрибрю- шиннуо инъекцию лабораторным животным в след/ющем объеме: мышам - 0,3-0,5 мл, крысам и морским свинкам - 0,8-1,0 мл и с- кроликам - 3-5 мл на одно животное.

Пример 1. Цель исследования - показать преимущество предлагаемого состава А-2ПТК в плане стимуляции образования ПМФ по сравнению с 2%-ным раствором пептона в динамике, ® Для этого мышей линии СВА, массой 20-22 г разделили на 3 группы по 60 голов в каждой:

I группе вводили внутрибрюшинно ир- ритант А-2ПТК в объеме 0,3 мл (состав I); 5 ц группе вводили 2%-ный раствор пептона в объеме 5 мл,

III группе вводили 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

Через 1,5,10,15,20,25 и 30 суток прово- 0 дили дренаж брюшной полости животных охлажденной средой N° 199 с 10 ед/мл гепарина. Затем полученный смыв центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин, супернатант сливали, а к осадку клеток экс- 5 судата добавляли 1 мл среды 199. В полученной взвеси определяли качественный состав клеток экссудата в процентех и количество ПМФ известными методами.

Эксперименты проведены с 3-кратными 0 повторными исследованиями.

Через сутки в опытной (I группе) количество ПМФ было в 2,7 раза больше в сравнении с прототипом (II группа) и в 3,6 раза по сравнению с контролем. Максимальный пик е индукции наблюдался на 5 сутки. В этом случае относительнее количество ПМФ в опытной гру ппе(А-2АТК) доходило до 100%, в прототипе-до 95%, а в контроле-до 29%. На этот период исследования при подсчете ПМФ в камере Горяева их абсолютное количество в опытной группе превосходило прототип в (&;8 х 10е клеток/мл) 2,7, а контроль в 17,6 раз.

Дальнейшие динамические исследования по подсчету ПМФ и относительному клеточному составу перитонеального экссудата позволило определит фон постепенного уменьшения ПМФ в опытной группе по сравнению с прототипом и контролем. Так, в частности, на 30 сутки исследования количества П МФ в группе мышей, индуцированных препаратом А-2ПТК, было больше в 2,3 раза по сравнению с прототипом и в 3,5 раза больше по сравнению с контролем.

Необходимо также отметить тот факт, что при введении препарата А-2ПТК индуцируется сравнительно большее количество лимфоцитов, обнаруживаемых в мазках перитонеального экссудата, по сравнению с прототипом и контролем.

На 7-10 сутки после внутрибрюшинного введения ирританта А-2ПТК, образуются зерна белого цвета, восковой консистенции, сохраняющиеся в течение 85-90 суток.

На следующем этапе в сравнительных исследованиях изучались такие свойства, как скорость роста и образование монослоя ПМФ. Перед помещением перитонеального смыва на стерильные, пластиковые чашки Петри, определяли процентное содержание жизнеспособных ПМФ. Для этого в 1 мл смыва вносили 0,1-0,3 мл 0,1 %-ного водного раствора трипановой сини бромфеноло- вого, или бромтимолового синего, или генцианвиолета. Через 10-15 минут инкубации при комнатной температуре в присутствии красителя вносили образец смыва в камеру Горяева и подсчитывали количество неокрашенных (жизнеспособных) ПМФ по общепринятому способу и определяли их процентное содержание.

Как показали проведенные исследования, процент жизнеспособности ПМФ, полученных с применением препарата А-2ПТК, составил 92,3 ± 0,8%, по прототипу 72,8±0,4%, а в контроле 68,2±0,3%. Таким образом, ПМФ, полученные с применением предлагаемого препарата в 1,3 раза превосходило по своей жизнеспособности клетки, полученные по прототипу и в 1,3 раза - в контроле.

После подсчета количества ПМФ взвесь клеток, полученных в результате дренажа брюшной полости, в стерильных условиях помещали на 2 ч в пластиковые чашки Петри диаметром 90-100 мм. Затем смыв удаляли с чашек, в адгезированные ПМФ заливали средой № 199 с 20% сыворотки крупного рогатого скота. Как показали проведенные нами исследования ПМФ, полученные с применением А-2ПТК, через 6-8 ч образо0

вывали монослой, занимающий 95 ,4-98,3% поверхности чашки, тогда как в прототипе и контроле монослой формировался через 18-24 ч на поверхности в 82,3% и 71,5%

соответственно.

Нами проводилось также и культураль- ное изучение перитонеального экссудата, полученного от мышей вышеуказанных групп. Для этого, перед помещением пери0 тонеального смыва на стерильные пластиковые чашки Петри 100 мм, определяли процентное содержание жизнеспособных ПИФ. При этом, в 1 мл смыва вносили 0,1- 0,3 мл 0,1% водного раствора трипанового

- синего и генцианвиолета. Через 10 мин инкубации при комнатной температуре в присутствии красителя вносили образец перитонеального смыва в камеру Горяева и подсчитывали количество неокрашенных ПМФ по известному способу и определяли процентное содержание клеток. На основании полученных результатов было отмечено, что процентжизнеспособныхПМФ, полученных в 1 группе, составил 95,8 ± 0,72%, во II группе - 71,5±0,2%, а в III группе 5 65,2±0,17%.

После определения количества ПМФ перитонеальный экссудат помещали на 2 часа в пластиковые чашки Петри. Затем смыв удаляли, а адгезированные ПМФ за0 ливали средой N 199 с 20% сыворотки крупного рогатого скота. Проведенные исследования показали, что ПМФ, полученные от I группы мышей, уже через 6-8 ч образовали монослой занимающий 96,1-99,2% по5 верхности чашки, в то время, как поданным, полученным от мышей II и III групп, монослой ПМФ формировался через 18-24 ч на поверхности 82,5% и 70,2%, соответственно.

0Нами были апробированы три состава

стимулятора, но, поскольку для состава III со средними значениями количества ингер- диентов при проведении испытаний получались сходные данные, мы представили

5 результаты, полученные при использовании стимулятора с граничными значениями.

Таким образом, на основании полученных результатов можно отметить, что разработанный нами состав для стимули0 рованной индукции ПМФ-А-2ПТК, позволяет значительно сократить время формирования оптимального количества ПМФ, необходимого для получения монослоя. Кроме того, ПМФ, полученные с применением ирританта А-2ПТК, способны за

5

значительно короткий промежуток времени формировать монослой клеток.

Оптимальное количество ПМФ при использовании А 2П ТК для получения монослоя удается получить, спустя 1 сутки, тогда

как в прототипе этот результат достижим через 5 суток.

То есть внутрибрюшинное введение предлагаемого соединения А-2ПТК позволяет сэкономить 4 суток, что является важным моментов в процессе получения ПМФ, при этом выход перитонеальных макрофагов увеличивается в 2-2,7 раза.

Формула изобретения

Стимулятор индукции перитонеальных макрофагов для экспериментального животного, содержащий высокомолекулярный белок, отличающийся тем, что, с целью усиления индукции перитонеальных макрофагов, в качестве высокомолекулярного белка используют 10%-ный раствор пепсин, а состав дополнительно содержит гель гидро17-23

16-24 8-12 4-6

Остальное

окиси алюминия, коммерческий 20%-ный раствор поливинилпирролидона М.м. 280000-360000 Дальтон, 0,25%-ный раствор трипсина коммерческий и 10%-ный раствор кальция хлорида при следующем соотношении компонентов, об.%: гель гидроокиси алюминия коммерческий 20%-ный раствор по- 0 ливинилпирролидона

с мол. м,280000-360000 Дальтон

10%-ный раствор кальция хлорида

5 10%-ный раствор пепсина

0,25%-ный раствор трипсина (100-128 единиц) коммерческий

0