Способ определения количества розеткообразующих клеток Советский патент 1988 года по МПК G01N33/49 

4

СО ел

о

САР

Изобретение относится к иммуноло- : гни,

Цель изобретения - повьшение точности s упрощение способао

Способ осуществляют следующим образом.

Пример . Забиршш из пальиа 0,31 МП крови. Эритроциты лизировали путем добавления 9 мл дистиллирован- ной воды на 30 с, затем добавляли 1 мл 10-кратного раствора Хенкса.

Центрифугировали при 200g 5 мин 5 затем осадочную жидкость сливали к осгдку добавляли 0,4 мл среды 199. В тгункн. планшета для ш«1мунологичес киг: реакций зализали по мл полученной суспензии клеток, затем по 0,05 мл суспензии эритроцитов барана или эритроцитов 1-1ыши или кле ток пекарских дрозюкей, убитых нагреванием. Планшет закрывали крышкой и центрифугировали при 200g в течение 5 мин. Инкубировали при А С в течени 30 мин. Затем в каждую лунку планше- та приливали по 4л раствора, содержащего OjlS МП глутарового альдегида и 2% формальдегида на фосфатном буфере (рН 794). Выдерживали при комнатной тe 9пepaтype 5 мин, после че™- го надосадочную жидкость стряхивали, добавляли Ojl МП дистиллированной воды осадок ресуспендирозапи и делали мазки размером 0,8-)(0,8 см. Для мака брали Oj025 МП полученной суспен- зии.

Мазки делали на крышке лланшета, подготовленной следуюищм образом На поверхность крьшки наносили тонкий прозрачный слой сыворотки при помощи марлевого тампона;, Сыворотку высушивали на воздухе, затем фиксиро вапи метанолом - к поверхности крьт- ки плотно грикладывали Лист фильтровальной бумаги размером см, который пропитывали метанолом (1 ,5 мл сверху накладывали полиэтипеновую :; пленку такого же размера для умень-- ше::шя испарения метанола и выдерживали в течение 10 мин. Такой лист бумаги с полиэтиленовой пленкой можно хранить в герметичной посуде и ис пользовать несколько раз, Крьппку с фиксированным слоем белка высушивали от метанола и наносили сетку в виде квадратов размером 0,,9 см (всего 80 квадратов) при помогай линейки и острого предмета (напримерj скальпеля или игльО. Ппастинаа подго

д

5 0 5 О s

0 5

0

5

топленная таким способом, может храниться при комнатной температуре не менее 2 мес. При помощи острого предмета можно написать на пластине всю необходимую информациюо

Маяки высушивали на воздухе и фиксировали метанолом тем же способом, как слой белка, нанесенный на пластину.

После высушивания пластину накрывали лист ом фильтровальной бумаги размером см, прогштанным раствором метилового зеленого пиронина (1,5 мл краски) J сверху накладьшали лист полиэтиленовой пленки такого же размера. Выдерживали 20 -1ИН„ Такой лист бумаги с полиэтиленовой пленкой пропитанный раствором краски, можно хранить в герметично закрытой посуде и использовать несколько раз.

Окрашен1-гый препарат высушивали на воздь хе.. Затем на поверхность капали 10-12 капель иммерсионного масла (в общей сложности 1 мл), накрывали прозрачной целлофановой пленкой размером см, пленку разравниБали при по- . мощи тампона из марли так. чтобы под ней не оставалось п;; зырьков воздуха Препарат готов к микроскопиронанию

П р и м е р 2в В каждую лунку планшета, содержащего осадок розеток и клеток, полученньй так, как описано в примере , приливали по 0,05 мл раствора, содержащего 0,20 мл глутарового альдегида и 2,5% формальдегида на фосфатном буфере (рН /,,4)

Выдерживали при комнатной температуре 5 миНз затем надосадочную жидкость стряхивали, осадок ресуспенди- ровали и делали мазки размером 0,8 см из 0,025 МП полученной суспензии „ Мазкр делали на крышке планшета дли иммунологических реакхдай, подготовленной так же, как описано Е гфи- мере К Все остапькые операции делали так же, как в примере 1 с той лшчь раэ1-шцей,, что в качестве белка использовали белок яйца

Предлагаемьш способ позволяет существенно повысить точность определения количества розеткообразующик клеток, поскольку мазок на пластмассу, покрытую слоем белка, ложится ровно без конгломератов, а дозированкое количество суспензии клеток при четко огран1 1ченной площади мазка (0,8 0,8 см) позволяет получать мазки ад1 наковой тогдаины.

31

11редля7 аемый способ -позволяет лучать мазок более однородный, чем известный, что выражается в достоверном (Р 0,001) и существенном (в среднем в 5,5 раза) уменьшении количества выявленных конгломератов. Увеличение однородности мазка приво- ,дит к повьплению точности получаемг,1х результатов, поскольку просчет розеток в конгломератах приводит к получению искаженных результатов. Повышение точности результатов по предлагаемому способу в сравнении с известным выражается в уменьшении разности между максимальным и минимальным значениями Е-РОК, полученными в результате просчета трех случайно выбранных полей одного и того же препарата, а также вследствие этого уменьшения среднеквадратической ошибки m (в 1,28-8,4 раза) просчета трех случайно выбранных полей одного и того же препарата. Кроме того,предлагаемый способ приготовления препара- тов.имеет большие преимущества по сравнению с известным и в затратах труда и материалов.

Затраты материалов, необходимые при реализации предлагаемого способа значительно меньше, чем затраты материалов в результате приготовления препаратов по известному (базовому) способу, в предлагаемом способе вместо предметных и дефицитных покровных стекол.применяется крышка планшета, которую ранее выбрасывали после использования планшета, и целлофановая пленка, которая дешева и доступна. Кроме того, имеется экономия р.астворителей, краски, отпадает необходимость наличия станка для шлифовки стекол. Существенное значение имеет уменьшение количества глутаро- вого альдегида, которьй является токсичным веществом.

Использование предлагаемого способа требует значительно меньше растворителей, в частности метанола, не требует этанола, диэтилового эфира и ксилола (необходимого для растворения канадского бальзама), что само по себе, представляет не только экономию, но и улучшение условий труда вследствие уменьшения контакта работющего с растворителями

ЗВ прсдчожеи юм способе уменьшается количество используемого глутарово- го альдегида в 15-20 раз, что также дает эконоьп5ю дефицитного реактива и существенно улучшает условия труда, поскольку глутаровьш альдегид является ядовитым, летучим веществом.

Замена основной части глутарового

альде ида не представляет трудностей поскольку фомальдегид широко доступен, так как формалин широко используют в гистологии, и пары формальдегида нетоксичны,

Улучшение условий труда в предлагаемом способе состоит также в отсутствии необходимости шлифовки стекол для нанесения на них надписей(в результате чего образуется стеклянная

пьшь, проникающая в легкие), так как надпись на пластмассе легко сделать острым предметом.

Затраты труда на осуществление предлагаемого способа меньше, чем

на осуществление известного. При обследовании 100 человек манипуляцией с 5 крышками планшеток и 5 прямоуголь- шками целлофана меньше, чем с 200 предметными и 400 покровными стеклами. .

Кроме того, при использовании крышек планшетов полностью исключается необходимость мытья, шлифовки и обезжиривания большого количества стекол, Все это сокращает время приготовлекия препаратов при обследовании 100 человек в 3 раза.

Формула изобретения

Способ определения количества розет- кообразуюших клеток, включающий постановку реакции розеткообраэовакия, фиксацию клеток фосфатным буферным раствором, содержащим глутаровый альдегид, приготовление мазков, их окрашивание и подсчет клеток, отличающийся тем, что, с целью по- вьш1ения точности и упрощения способа, фиксацию клеток осуществляют раствором, дополнительно содержащим 2,0- 2,5% формальдегида, глутаровый альдегид добавляют в конечный концентрат 0,15-0,2%, а мазки готовят на пластмассовой пластине с предваритель- но нанесенным слоем белка, фиксирован- Ным метанолом.

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения поньгаение точности и упрощение способа. Дпя этого эритроциты пробы крови из пальца лизируют, добавляя на 0,5 мин дистиллированную воду, затем 10-кратный р-р Хенкса, центрифугируют при 200g 5 мин, к осадку добавляют среду 199, ставят реакции розеткообразова- ния, фиксируют клетки фосфатным буферным р-ром, содержащим 2,0-2,5% формальдегида. Глутаровый альдегид добавляют в конечный концентрат 0,15- 0,2%. На пластмассовую пластину наносят слой белка, фиксированный метанолом, на эту пластину наносят мазок, также фиксированный метанолом, окрашивают препарат и подсчитывают клетки.