Способ определения активности карбоангидразы Советский патент 1990 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способу определения дегидратирующей активности карбоан- гидразы (КА), и может быть использовано в биотехнологии, физиологии растений, а также в медицине в диагностических целях.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа, достигается тем, что определение активности фермента осуществляют злектрометричес- ки, регистрируя время образования продукта реакции по изменению рН на О,05-0,01 ед. в растворе с буферной емкостью 0,002-0,01 М и концентрацией бикарбоната 1-100 мМ.

Пример 1. Для определения активности КА в реакции дегидратации углекислоты используют электрометрическую систему. В реакционную ячейку наливают 20 мл 0,002 М фосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 0,1 мкг гомогенной КА, выделенной из листьев бобов (II), и 0,001 М р-меркаптоэта- нола. Реакционную смесь перемешивают и термостатируют до установления постоянного рН и температуры (2° С) в течение 5 мин. Реакцию начинают введением 1 мМ (0,1 мл 0,2 Н раствора) бикарбоната натрия при непрерьшном перемешивании. Самописец вычерчивает кри- .вую изменения рН но времени. Регистриру01

OD

ро с со

ют время изменения рН на 0,01 ед. (t,), после чего самописец выклк1ча- ют. Реакционную смесь после зарер- шения реакции вьшивают, ячейку неод- . некратно промьшают спиртом и бидис- тиллированной водой. Контроль или время некатализируемой реакции (t,) дегидратации бикарбоната измеряют аналогично определению t, однакоJQ реакционную смесь предварительно кипятят 3 мин на водяной бане и затем охлаждают до , Полученные значения t J 10cиt, 20с подставляют в формулу: А --/мг

- к белка, и, таким образом, получают

величину активности КА, выраженную в условных единицах. Для расчета истинной Дегидратирующей активности20 КА-А необходимо знать значения ско- ростей катализируемой (V |) и некатализируемой (Vj) реакций, что связано с определением точных концентраций водородных ионОв СН,, ко- 25 торые вовлекаются в процесс деп-щра- тации НСОэ-ионов. Для это1;о проводят титрование реакционной смеси, состоящей из всех компонентов, используемых для определения А, за исключением,,, субстрата. Вместо субстрата в реакционную смесь добавляют 0,01-0,05 н, NaOH до получения соответств.ующего сдвига рН. С учетом времени (t к и to), за которое происходят эти сдви- ги рН в процессе реакции, определяСн :

ют значения скоростей V --- иV. -1р.

й40

Конечный результат - активность

КА находят из разности скоростей (. Vp ), соотнесенной к количеству белка (мг белка) в реакционной смеск:

А и выражают в мкМ де- 45

I мг белка

гидратированного бикарбоната за 1 мин 1 мг белка (мкМ HCOj/мин мг белка).

Окончательное значение А, , полученное в результате данного измере- ния, равно 7,5t 0,075 мкН/мин мг белка.

Пример 2. Ход определения активности КА аналогичен примеру 1, однако в качестве источника фермента используют 0,2 мл донорской крови человека, содержащей 0,2 мг белка разведением водой 1:400000, а реакцию начинают введением 5 мМ (0,5 мл 0,2 М раствора) бикарбоната натрия в имидозольньй буфер с рН 7,1 и буферной емкостью 0,009 М. На экспериментальной кинетической кривой, записанной потенциометром .самописцем, фиксируют сдвиг. рН, равный 0,02 ед., и определяют соответствующее ему время реакции: t

-к

18 с. Аналогичным образом измеряют время контроля t 34 с. С использованием полученных значений ц и V и учетом количества белка в реакционной смеси рассчитывают А (4,510,05) ед./мг белка. Для определения истинного значения активности КД-А определяют точную концентрацию протонов Н, соответствующую сдвигу рН 0,02 ед. Для этого реакционную смесь того же состава, как и использованную для нахождения А, титруют добавлением. 0,02 мл 0,01 н. NaOH. Полученная СН 10 х10 М; соотнеся ее ко времени t,. и to, рассчитьшают .соответственно V, , 18,8х10 %/мин и .Vj,. 8,8 v 1 О М/мин. Принимая во внимание концентрацию белка в реакционной смеси (0,2 мг), по формуле для нахождения А определяют ее значение А { (70 0,7) 10 М/мин мг белка.

Формула изобретения

Способ определения активности карбоангидразы путем добавления исследуемого образца к субстратно-буферной смеси и регистрации времени образования продукта реакции при параллельном проведении тех же операций с инактивирбванньм образцом, последующим расчетом активности, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, используют буферный раствор с рН 7,0-7,2 и буферной емкостью 0,002-0,03 М, концентрацию бикарбоната натрия 1-100 мМ, при этом о-времени образования продукта реакции судят по времени изменения рН на 0,05- 0,01 ед.

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения дегидратирующей активности карбоангидразы (КА), и может быть использовано в биотехнологии, физиологии растений и медицине. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Активность КА измеряют электрометрически, по изменению PH в ходе реакции дегидратации углекислоты. Система для определения активности КА включает высокочувствительный PH-метр, самописец и компенсатор, обеспечивающий соответствие всей шкалы PH-метра 0,05-0,2 ед. PH. Реакцию дегидратации углекислоты проводят в 20 мл 0,002-0,03 М (или имидозольного, или вероналового) буфера со значением PH 6,8-7,2. Реакцию инициируют быстрым введением раствора субстрата - бикарбоната натрия (1-100мМ) в реакционную смесь, содержащую исследуемый образец. При этом происходит увеличение PH на 0,01-0,05 ед. Регистрируется время, за которое происходит сдвиг PH на 0,01 ед. Параллельно проводятся измерения с инактивированным образцом и рассчитывают активность по формуле, приведенной в описании.